一、實驗原理

稀xi釋shi平ping板ban測ce數shu是shi根gen據ju微wei生sheng物wu在zai高gao度du稀xi釋shi條tiao件jian下xia固gu體ti培pei養yang基ji上shang所suo形xing成cheng的de單dan個ge菌jun落luo是shi由you一yi個ge單dan細xi胞bao繁fan殖zhi而er成cheng這zhe一yi培pei養yang特te征zheng設she計ji的de計ji數shu方fang法fa，即ji一yi個ge菌jun落luo代dai表biao一yi個ge單dan細xi胞bao。計ji數shu時shi，首shou先xian將jiang待dai測ce樣yang品pin製zhi成cheng均jun勻yun的de繁fan殖zhi稀xi釋shi液ye，盡jin量liang使shi樣yang品pin中zhong的de微wei生sheng物wu細xi胞bao分fen散san開kai
，使shi其qi成cheng單dan個ge細xi胞bao存cun在zai
，否fou則ze一yi個ge菌jun落luo就jiu不bu隻zhi是shi代dai表biao一yi個ge細xi胞bao，再zai取qu一yi定ding稀xi釋shi度du
、一(yi)定(ding)量(liang)的(de)稀(xi)釋(shi)液(ye)接(jie)種(zhong)到(dao)平(ping)板(ban)中(zhong)，使(shi)其(qi)均(jun)勻(yun)分(fen)布(bu)於(yu)平(ping)板(ban)中(zhong)的(de)培(pei)養(yang)基(ji)內(nei)。經(jing)培(pei)養(yang)後(hou)
，由(you)單(dan)個(ge)細(xi)胞(bao)生(sheng)長(chang)繁(fan)殖(zhi)形(xing)成(cheng)菌(jun)落(luo)，統(tong)計(ji)菌(jun)落(luo)數(shu)目(mu)，即(ji)可(ke)計(ji)算(suan)出(chu)樣(yang)品(pin)中(zhong)的(de)含(han)菌(jun)數(shu)。此(ci)記(ji)數(shu)方(fang)法(fa)所(suo)計(ji)算(suan)的(de)菌(jun)數(shu)是(shi)培(pei)養(yang)基(ji)上(shang)長(chang)出(chu)來(lai)的(de)菌(jun)落(luo)數(shu)，故(gu)又(you)稱(cheng)活(huo)菌(jun)計(ji)數(shu)。一(yi)般(ban)用(yong)於(yu)某(mou)些(xie)產(chan)品(pin)檢(jian)定(ding)
，如(ru)根(gen)瘤(liu)菌(jun)劑(ji)等(deng)產(chan)品(pin)檢(jian)定(ding)，生(sheng)物(wu)製(zhi)品(pin)檢(jian)驗(yan)
，土(tu)壤(rang)含(han)菌(jun)量(liang)測(ce)定(ding)及(ji)食(shi)品(pin)、水源的汙染程度的檢驗。

自(zi)然(ran)條(tiao)件(jian)下(xia)
，微(wei)生(sheng)物(wu)常(chang)以(yi)群(qun)落(luo)狀(zhuang)態(tai)存(cun)在(zai)，這(zhe)種(zhong)群(qun)落(luo)往(wang)往(wang)是(shi)不(bu)同(tong)種(zhong)類(lei)微(wei)生(sheng)物(wu)的(de)混(hun)合(he)體(ti)。為(wei)了(le)研(yan)究(jiu)某(mou)種(zhong)微(wei)生(sheng)物(wu)的(de)特(te)性(xing)或(huo)者(zhe)要(yao)大(da)量(liang)培(pei)養(yang)和(he)使(shi)用(yong)某(mou)種(zhong)微(wei)生(sheng)物(wu)
，必(bi)須(xu)從(cong)這(zhe)些(xie)混(hun)雜(za)的(de)微(wei)生(sheng)物(wu)群(qun)落(luo)中(zhong)獲(huo)得(de)純(chun)培(pei)養(yang)，這(zhe)種(zhong)獲(huo)得(de)純(chun)培(pei)養(yang)的(de)方(fang)法(fa)稱(cheng)為(wei)微(wei)生(sheng)物(wu)的(de)分(fen)離(li)與(yu)純(chun)化(hua)。

在(zai)自(zi)然(ran)界(jie)中(zhong)，土(tu)壤(rang)是(shi)微(wei)生(sheng)物(wu)生(sheng)活(huo)的(de)良(liang)好(hao)環(huan)境(jing)，其(qi)中(zhong)生(sheng)活(huo)的(de)微(wei)生(sheng)物(wu)數(shu)量(liang)和(he)種(zhong)類(lei)都(dou)是(shi)極(ji)其(qi)豐(feng)富(fu)的(de)，因(yin)此(ci)土(tu)壤(rang)是(shi)人(ren)類(lei)開(kai)發(fa)利(li)用(yong)微(wei)生(sheng)物(wu)資(zi)源(yuan)的(de)重(zhong)要(yao)基(ji)地(di)。土(tu)壤(rang)中(zhong)的(de)微(wei)生(sheng)物(wu)數(shu)量(liang)、種類與土壤肥力有關

，肥沃的土壤中多，貧瘠土壤中少。其生理類群則與土壤的其它理化性質，如通氣、pH有關，例如在通氣良好的菜園土中，好氣性微生物占有絕對優勢。本實驗以菜園土為材料分離土壤中的好氣性細菌，並進行數量測定。

分離微生物時
，一般是根據該微生物對營養、pH、yangqidengyaoqiudebutong，gonggeitamenshiyideshenghuotiaojian

，huojiarumouzhongyizhijizaochengzhiliyugaijunzhongshengchang，buliyuqitajunzhongshengchangdehuanjing

，congertaotaibuxuyaodejunzhong。fenliweishengwuchangyongdefangfayouxishipingbanfenlifahehuaxianfenlifa，genjubutongdecailiao，keyicaiyongbutongfangfa，qizuizhongmudeshiyaozaipeiyangjishangchuxianyufenliweishengwudedangejunluo，biyaoshizaiduidangejunluojinyibufenlichunhua。zaiyongxishipingbanfenliweishengwushi
，haikeyitongshicedingdaifenlideweishengwudeshuliang。

放線菌與細菌同屬原核微生物，是重要的抗生素產生菌，在土壤中的數量僅次於細菌，尤其是在有機質豐富、透氣性好的中性到微堿性土壤中的數量較多。本實驗采用高氏一號瓊脂培養基分離和計數菜園土中的放線菌。

真菌在土壤中的數量次於細菌和放線菌，主要在有機質豐富、透(tou)氣(qi)性(xing)好(hao)的(de)偏(pian)酸(suan)性(xing)土(tu)壤(rang)中(zhong)較(jiao)多(duo)。分(fen)離(li)土(tu)壤(rang)中(zhong)的(de)真(zhen)菌(jun)並(bing)不(bu)難(nan)，但(dan)由(you)於(yu)其(qi)菌(jun)落(luo)大(da)
，容(rong)易(yi)擴(kuo)展(zhan)，計(ji)數(shu)準(zhun)確(que)性(xing)較(jiao)低(di)。本(ben)實(shi)驗(yan)采(cai)用(yong)加(jia)有(you)氯(lv)黴(mei)素(su)或(huo)慶(qing)大(da)黴(mei)素(su)和(he)孟(meng)加(jia)拉(la)紅(hong)的(de)馬(ma)丁(ding)氏(shi)培(pei)養(yang)基(ji)分(fen)離(li)及(ji)計(ji)數(shu)菜(cai)園(yuan)土(tu)中(zhong)的(de)真(zhen)菌(jun)。按(an)一(yi)般(ban)資(zi)料(liao)介(jie)紹(shao)為(wei)鏈(lian)黴(mei)素(su)
，但(dan)此(ci)種(zhong)抗(kang)生(sheng)素(su)要(yao)先(xian)配(pei)成(cheng)一(yi)定(ding)濃(nong)度(du)的(de)溶(rong)液(ye)，且(qie)應(ying)於(yu)倒(dao)平(ping)板(ban)前(qian)才(cai)加(jia)入(ru)培(pei)養(yang)基(ji)中(zhong)。在(zai)此(ci)培(pei)養(yang)基(ji)上(shang)，放(fang)線(xian)菌(jun)和(he)細(xi)菌(jun)被(bei)氯(lv)黴(mei)素(su)或(huo)慶(qing)大(da)黴(mei)素(su)和(he)孟(meng)加(jia)拉(la)紅(hong)所(suo)抑(yi)製(zhi)，但(dan)大(da)多(duo)數(shu)真(zhen)菌(jun)能(neng)夠(gou)生(sheng)存(cun)，且(qie)其(qi)菌(jun)落(luo)受(shou)孟(meng)加(jia)拉(la)紅(hong)的(de)抑(yi)製(zhi)而(er)較(jiao)小(xiao)，從(cong)而(er)避(bi)免(mian)了(le)某(mou)些(xie)真(zhen)菌(jun)的(de)擴(kuo)散(san)蔓(man)延(yan)而(er)帶(dai)來(lai)的(de)數(shu)量(liang)上(shang)的(de)誤(wu)差(cha)。

二

、實驗材料

1、活材料：蘇雲金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis）菌劑。

2、培養基：牛肉膏蛋白腖瓊脂培養基；高氏一號瓊脂培養基；加有氯黴素（或慶大黴素）和孟加拉紅的馬丁氏瓊脂培養基:在1000mL培養基中加入注射用氯黴素2mL，孟加拉紅33.4mg，均於滅菌前加入。

3、材料：肥沃茶園土。

實驗用品

內裝15～20個玻璃珠的90mL無菌水、9mL無菌水
、直徑9cm的無菌平皿、1mL無菌吸管、天平、稱樣瓶
、記號筆、玻璃刮鏟、經2mm土壤篩過篩的菜園
、天平
、試管架、無菌稱量紙、酒精燈、火柴、接種環、無菌水。

三、實驗方法

（一）稀釋平板測數法

1、樣品稀釋液的製備

準確稱取待測樣品10g，放入裝有90mL無菌水並放有小玻璃珠的250mL三角瓶中，用手或置搖床上振蕩20min，使微生物細胞分散
，靜置20～30s
，即成10－1稀釋液；再用1mL無菌吸管，吸取10－1稀釋液1mL，移入裝有9mL無菌水的試管中，吹吸3次
，讓菌液混合均勻，即成10－2稀釋液；再換一支無菌吸管，吸取10－2稀釋液1mL，移入裝有9mL無菌水的試管中，也吹吸3次，即成10－3稀釋液
；以此類推


，連續稀釋，製成10－4、10－5、10－6

、10－7、10－8、10－9等一係列稀釋菌液。

用yong稀xi釋shi平ping板ban計ji數shu時shi，待dai測ce菌jun稀xi釋shi度du的de選xuan擇ze應ying根gen據ju樣yang品pin確que定ding。樣yang品pin中zhong所suo含han待dai測ce菌jun的de數shu量liang多duo時shi，稀xi釋shi度du應ying高gao，反fan之zhi則ze低di。通tong常chang測ce定ding細xi菌jun菌jun劑ji含han菌jun數shu時shi
，采cai用yong10－7、10－8

、10－9稀釋度，測定土壤細菌數量時
，采用10－4、10－5
、10－6稀釋度，測定放線菌數量時，采用10－3、10－4
、10－5稀釋度，測定真菌數量時，采用10－2、10－3、10－4稀釋度。

2、平板接種培養

平板接種培養有混合平板培養法和塗抹平板培養法兩種方法。

⑴混合平板培養法

將無菌平板編上10－7、10－8、10－9號碼，每一號碼設置三個重複
，用無菌吸管按無菌操作要求吸取1×10－9稀釋液各1mL放入編號10－9的3個平板中，同法吸取10－8稀釋液各1mL放入編號1×10－8的3個平板中
，再吸取1×10－7稀釋液各1mL放入編號1×10－7的3個平板中，由低濃度向高濃度時，吸管可不必更換。然後在9個平板中分別倒入已熔化並冷卻至45～50℃的細菌培養基，輕輕轉動平板，使菌液與培養基混合均勻，冷凝後倒置，在30℃下培養。至菌落長出後即可計數。

⑵塗抹平板計數法

塗抹平板計數法與混合法基本相同，所不同的是先將培養基熔化後趁熱倒入無菌平板中，待凝固後編號，然後用無菌吸管吸取0.1mL菌(jun)液(ye)對(dui)號(hao)接(jie)種(zhong)在(zai)不(bu)同(tong)稀(xi)釋(shi)度(du)編(bian)號(hao)的(de)瓊(qiong)脂(zhi)平(ping)板(ban)上(shang)，每(mei)個(ge)編(bian)號(hao)設(she)三(san)個(ge)重(zhong)複(fu)。再(zai)用(yong)無(wu)菌(jun)刮(gua)鏟(chan)將(jiang)菌(jun)液(ye)在(zai)平(ping)板(ban)上(shang)塗(tu)抹(mo)均(jun)勻(yun)，每(mei)個(ge)稀(xi)釋(shi)度(du)用(yong)一(yi)個(ge)滅(mie)菌(jun)刮(gua)鏟(chan)
，更(geng)換(huan)稀(xi)釋(shi)度(du)時(shi)需(xu)將(jiang)刮(gua)鏟(chan)灼(zhuo)燒(shao)滅(mie)菌(jun)。在(zai)由(you)低(di)濃(nong)度(du)向(xiang)高(gao)濃(nong)度(du)塗(tu)抹(mo)時(shi)，也(ye)可(ke)以(yi)不(bu)更(geng)換(huan)刮(gua)鏟(chan)。將(jiang)塗(tu)抹(mo)好(hao)的(de)平(ping)板(ban)平(ping)放(fang)於(yu)桌(zhuo)上(shang)20～30min
，使菌液滲透入培養基內，然後將平板倒轉
，保溫培養，至菌落長出後即可計數。

（二）土壤中好氣性細菌的分離與計數

1
、土壤稀釋液的製備

按“稀釋平板測數法”的相同步驟進行
，按無菌操作法將土壤稀釋至10－6即可。

2、分離方法

可以用三種方法進行分離。

⑴混菌法：按“稀釋平板測數法”中的“混合平板培養法”進行
，使用的稀釋度為10－4、10－4

、10－6三個，各做3個重複。

⑵塗抹法：按“稀釋平板測數法”中的“塗抹平板測數法”進行，使用的稀釋度為10－3、10－4、10－5三個
，各做3個重複。

以上兩法又統稱為稀釋平板分離法，可同時用於所分離菌的計數。

⑶劃線法：用滅菌接種環沾取10-1稀釋液1環於已凝固的平板上進行劃線（圖示）。劃線可按以下兩種方式進行，一種為交叉劃線法，是在平板的一邊做第一次“Z”字形劃線。轉動培養皿70°角
，將接種環在火上燒過並冷卻後，通過第一次劃線部分，做第二次“Z”字形劃線。同法進行第三次、第四次劃線。另一種為邊疆劃線法
，是從平板邊緣的一點開始
，連續作緊密的波浪式劃線，直至平板中央。轉動培養皿180°，再從平板另一邊（不燒接種環）同樣劃線至平板中央。劃線法實質上屬於一種“由點到線”的稀釋法，較適用於含菌比較單一的材料的純化，對於土壤這類微生物高度混雜的樣品則較少使用。

以上各種分離法，都應按無菌操作進行。所用的培養基若在倒平板前，按50μg/m L 的量加入用乙醇溶解的製黴菌素或放線菌酮（起抑製黴菌的作用）
，效果會更好。

3
、培養

將上述接種過土壤懸液的平板倒置，於28～30℃培養，至長出菌落為止（24～36h）。

4、挑菌純化

在zai平ping板ban上shang選xuan擇ze分fen離li較jiao好hao的de有you代dai表biao性xing的de單dan菌jun落luo接jie種zhong斜xie麵mian，同tong時shi作zuo塗tu片pian檢jian查zha，若ruo發fa現xian不bu純chun，應ying挑tiao取qu此ci菌jun落luo做zuo進jin一yi步bu劃hua線xian分fen離li
，或huo製zhi成cheng菌jun懸xuan液ye再zai做zuo稀xi釋shi分fen離li，直zhi至zhi獲huo得de純chun培pei養yang體ti。

5、計數

選取混菌法和塗抹法中每皿菌落數30～300的平板，分別按“稀釋平板測數法”中的“混合平板測數法”和“塗抹平板測數法”中(zhong)的(de)公(gong)式(shi)計(ji)數(shu)。這(zhe)樣(yang)求(qiu)得(de)的(de)是(shi)每(mei)克(ke)原(yuan)始(shi)土(tu)樣(yang)中(zhong)的(de)活(huo)菌(jun)數(shu)，若(ruo)要(yao)折(zhe)算(suan)為(wei)每(mei)克(ke)幹(gan)土(tu)的(de)含(han)菌(jun)數(shu)，還(hai)應(ying)將(jiang)此(ci)數(shu)值(zhi)除(chu)以(yi)幹(gan)土(tu)在(zai)土(tu)樣(yang)中(zhong)所(suo)占(zhan)的(de)質(zhi)量(liang)分(fen)數(shu)(烘幹土的質量/原土樣的質量)。

注：土壤含水量的測定是將一定質量的土壤在105～110℃下烘幹至恒重，再稱幹重。

（三）、土壤中放線菌的分離與計數

1、土壤稀釋液的製備

按實驗“稀釋平板計數法”中的方法進行，將菜園土稀釋至10－5。在稀釋時，可在盛無菌水的三角瓶中加10滴100g/L的石炭酸溶液和50μg/m L 的製黴菌素以抑製細菌和黴菌的生長。

2

、分離方法

采用稀釋平板分離法

，又可分為兩種方法。

⑴混菌法：按“稀釋平板計數法”中的“混合平板培養法”進行，所不同者是稀釋度
，應采用10－3
、10－4、10－5三個稀釋度
，各做3個重複。

⑵塗抹法：按“稀釋平板計數法”中的“塗抹平板計數法”進行
，應采用10－2、10－3、10－4三個稀釋度
，各做3個重複。

3、培養

將上述接種過土壤懸液的平板倒置於28～30℃培養4～5d。

4、挑菌純化

從平板中選擇分離較好的放線菌菌落（應與細菌菌落區別開）較接斜麵，並製片作純度檢查，若不純，應進一步將該菌作稀釋平板分離或劃線分離，直至獲得純培養。

（四）、土壤中真菌的分離純化與計數

1、土壤稀釋液的製備

按實驗“稀釋平板計數法”中的方法進行
，將土樣稀釋至10－4。

2、分離方法

采用稀釋平板分離法。又可分為兩種方法。

⑴混菌法：按“稀釋平板計數法”中的“混合平板培養法”進行
，所不同的是稀釋度，應選10-2、10－3、10－4三個稀釋度進行接種。

⑵塗抹法：按“稀釋平板計數法”中的“塗抹平板計數法”進行，所不同的是稀釋度，應選10-1

、10－2、10－3三個稀釋度進行接種。

3
、培養

將上述接種土壤懸液的平板倒置於28℃培養3～5d。

4
、挑菌純化

從長有單菌落的平板中選取典型的真菌菌落（包括酵母菌菌落）zhuanjiexiemian

，bingtongshizhipianzuochundujianzha。ruobuchun，yingjinyibutiaoqugaijunluocaiyonghuaxianfenli
，huozhichengjunxuanyejinyibuzuoxishifenli，zhizhihuodechunpeiyangtiweizhi。

5、計數

選取每皿菌落數在10～100之間的平板用於計數。不應遺漏酵母菌的菌落，必要時可製片檢查，以免誤為細菌菌落

，具體方法見土壤中好氣性細菌的分離與計數。

6、菌種保存

將分離到的真菌轉接到PDA斜麵上培養，待長好後，置於冰籍中保存，必要時進行深入研究。