1．原理

　　PBMC的密度與血液中的其他成分不同。紅細胞和粒細胞的密度較大
，為1.092左右；淋巴細胞和單核細胞的密度為1.076～1.090

；血小板為1.030～1.035。因此
，利用一種密度介於1.076～1.090之間、近於等滲的溶液（分層液）進行密度梯度離心，可使不同類別的血細胞按其相應密度分布
，從而被分離。

　　2．方法

　　1）聚蔗糖-泛影葡胺分層液法 聚蔗糖-泛影葡胺（Ficoll-hypaque，F-H）分層液為密度梯度離心法最常用的分離液
，其主要成分是聚蔗糖和泛影葡胺。聚蔗糖 （Ficoll） 分子量為40kD，具有高密度、低滲透壓、無毒性的特點；常用的Ficoll溶液濃度為6%，密度為1.020。泛影葡胺 （Hypaque） 用來增加密度，適量加入密度為1.200、濃度為34%的Hypaque於Ficoll溶液中，配成密度為1.077±0.001的分層液
，稱為淋巴細胞分層液
，用於淋巴細胞的分離。

　　分fen離li細xi胞bao時shi
，將jiang肝gan素su抗kang凝ning全quan血xue疊die加jia在zai分fen層ceng液ye上shang，使shi兩liang者zhe形xing成cheng一yi個ge清qing晰xi的de界jie麵mian。水shui平ping離li心xin後hou

，形xing成cheng不bu同tong層ceng次ci的de液ye體ti和he細xi胞bao區qu帶dai，從cong而er分fen離li出chuPBMC （圖1）。紅細胞和粒細胞密度大於分層液，同時因紅細胞遇Ficoll而凝集成串錢狀，沉積於分層液底部；血小板因密度小而懸浮於血漿中；PBMC的密度稍低於分層液
，故位於血漿層和分層液的界麵中，呈白膜狀。吸出單個核細胞，計數
，用台盼藍染色檢查細胞活力。

　　本法分離單個核細胞的純度可達95%，細胞獲得率達80%以上，細胞活性達95％以上

．小鼠淋巴細胞的比重與人淋巴細胞比重不同，若分離小鼠淋巴細胞應選用小鼠淋巴細胞分離液，比重1.092±0.001。

　　2）Percoll分層液法

　　Percoll是經過聚乙烯吡咯烷酮 （polyvinyl pyrolidone, PVP） 處理的矽膠顆粒混懸液，對細胞無毒性和刺激性。Percoll混懸液的矽膠顆粒大小不一
，經過高速離心後，可形成一個連續密度梯度，將比重不同的細胞分離純化。

　　將1份10XPBS與9份Percoll貯存液混合，製成等滲Percoll懸液
，此懸液被認為是100％Percoll懸液，其密度為1.1294g/ml。用PBS或細胞培養液稀釋100％Percoll而獲得所需密度的Percoll分離液用於相應細胞的分離。若分離淋巴細胞應使用1.0777g/ml
，配製時用稀釋液稀釋60％即可。

　　取比重1.077的Percoll分離液X ml與離心管中
，將等倍稀釋的抗凝血1/2 X ml 小心疊加在分離液上，經水平離心（1500rpm）後hou，便bian得de四si個ge細xi胞bao層ceng，從cong而er分fen離li出chu淋lin巴ba細xi胞bao。表biao層ceng為wei死si細xi胞bao殘can片pian和he血xue小xiao板ban，底di層ceng為wei粒li細xi胞bao和he紅hong細xi胞bao，中zhong間jian有you兩liang層ceng，上shang層ceng富fu含han單dan核he細xi胞bao，下xia層ceng富fu含han淋lin巴ba細xi胞bao。

　　該法是純化淋巴細胞和單核細胞的一種較好的方法
，淋巴細胞純度高達98%，單核細胞純度可達78%。