傳統的菌種保存方式簡介
• 斜麵保存法:微生物保存最基本的方法,可廣泛用於細菌、真菌等,保存期限非常短,斜麵容易幹裂。
• 液體石蠟保存法:可用於保存黴菌、酵母菌、放線菌及需氧菌,方法簡便,可防止斜麵幹燥和氧氣進入,但一些固氮菌、分枝杆菌、毛黴、厭氧菌等不適宜用此法。
• 甘油冷凍保存法:用於一般細菌的保存,需使甘油終濃度為20%左右,然後-20℃或-70℃以下保存。融化時需要水浴溶化。
• 真空冷凍保存法:具有低溫、幹燥、無氧的保存條件,適用於98%以上菌種的保存,但操作複雜,一般實驗室難以使用。
• 液氮保存法:基本所有微生物均可保存,並且保存時間長,但操作較為複雜而且需要設備,不適用於一般實驗室保存菌種。
• 沙土保存法
• 半固體保存法
瓷珠菌種保存法的原理
瓷珠菌種保存管是實驗室保存菌種的容器,管內有表麵凹孔小瓷珠用於細菌的吸附和保存,放置於-20℃或-80℃下便可創造幹燥、低溫、缺營養的環境,使菌株處於“休眠” 狀態,方可長期保存(視不同菌種與保存溫度,一般可保存3-10 年), 同時菌種保存管的取用和保存較為便利(取用複蘇及保存菌種僅需1分鍾)。
瓷珠菌種保存管的優點

• 用途:菌種保存、複蘇和運輸。
• 優點:操作簡單方便、菌種保存快速、包裝物體積小、菌種保存時間長。
• 操作簡單方便:挑取細菌新鮮純培養物,接入菌種保存管。
• 菌種保存快速:混勻後,吸出冷凍保存液。
• 包裝物體積小:1.8ml冷凍管。
• 菌種保存時間長:2-8℃可保存6個月;-20℃可保存12個月;-80℃可保存24個月。
瓷珠菌種保存管的使用方法
菌種保存流程
1.從培養18h以上的平板上刮去新鮮純培養物於菌種保存管中,配成大約3-4麥氏比濁度的菌懸液。
2.擰緊保存管,來回顛倒幾次使細菌乳化,不能旋搖。
3.用無菌移液器將菌種保存管內的液體吸取幹淨,妥善放置被吸出的液體。
4.擰緊保存管,迅速將其置於-20℃或-70℃冰箱中。
使用時的注意事項
• 被保存的菌種要求是經過純化後培養 18-24h 內的新鮮菌種(細菌18-24h,酵母菌需3 天,形成孢子的微生物保存孢子,而放線菌和絲狀真菌需培養7 天後保存),不宜使用老化或未經鑒定的菌種。
• 菌種保存濃度必須要做3-4 麥氏比濁度,如接種濃度過低將會降低複蘇效果。
• 待dai保bao存cun於yu菌jun種zhong保bao存cun管guan中zhong的de菌jun種zhong完wan全quan乳ru化hua均jun勻yun吸xi附fu在zai多duo孔kong小xiao瓷ci珠zhu後hou,要yao將jiang多duo餘yu的de菌jun種zhong保bao存cun液ye吸xi取qu出chu來lai並bing棄qi之zhi,否fou則ze在zai複fu蘇su時shi的de凍dong融rong過guo程cheng中zhong會hui損sun傷shang菌jun株zhu活huo性xing。
• 做厭氧菌保存時,應提供厭氧的環境,如厭氧箱、厭氧袋,菌種保存管中可通入氮氣來驅除保存菌種時所引入的氧氣。菌種複蘇時,也要創造厭氧的環境。
• 菌種複蘇完成後,對使用菌株需要進行再次純化,以保證菌株的單一性。
常見問題答疑
1、菌種保存管能保存黴菌及酵母菌嗎?
答:可以。對於黴菌等真菌需培養7 tianjinxingbaocun,erjiaomujunxupeiyangsantianjiangbaozixituoxialaijinxingbaocun,baocunguanzhongdexiaocizhukeyizuoweijiezhilaixifubaozihejunsi,xiangdangyushatubaocunfazhongshatuzuoweizaitiqidaodezuoyong。
2、所有的菌都能保存嗎?如果不是的話,什麼樣的菌可以保存?什麼樣的菌不可以保存?
答:可以。菌種保存的原理是預防或減緩DNA 複製時自發突變導致菌種退化,因此要創造代謝不活潑的狀態,而菌種保存時使菌種進入休眠態(孢子、芽孢),並創造幹燥、低溫、缺氧、缺營養的環境,創造的環境越接近此狀態,所保存的菌種的時間就越長,所以從原理上講,所有菌種都可用這種方法保存, 但需要注意的是,苛刻菌(如流感嗜血杆菌、腦膜炎萘瑟氏菌)等特殊細菌保存時,需-80℃或更低溫度保存,才可以做到更長期的保存。
3、能用菌種保存管永久保存菌株嗎?
答:溫度越低,保藏效果越好。從目前的試驗數據及實際保存效果來看,-20℃可保存1-5 年,-80℃或液氮中可保存5-10 年,不同菌種及不同的保存溫度保存時間會有所不同(例如:大腸、沙門等常規細菌-20℃我們目前可以保存到6年)。但需要注意的是所保存的菌種需每年抽檢進行生化特征的鑒定,確定菌株無變異。
4、菌種保藏時為什麼要進行分離純化?
答:分離純化後才能獲得單一菌株,單一菌株進行菌種保藏才有意義,防止菌種交叉汙染和變異,這也是菌種保存的基本原則。
5、菌種保存管對於平板來說,對挑選菌落個數有要求嗎?還是將整個平板的菌落全部刮入管中?
答:對於要保存的細菌一般是要進行2-3 次的純化,要保證一個平板上的菌是由單一菌落傳代而來的,所以在細菌保存的過程中,為了保證製備的菌懸液可以達到3-4MCF,是(shi)可(ke)以(yi)將(jiang)整(zheng)個(ge)平(ping)板(ban)的(de)的(de)細(xi)菌(jun)全(quan)部(bu)刮(gua)到(dao)管(guan)中(zhong)的(de),如(ru)果(guo)平(ping)板(ban)長(chang)的(de)比(bi)較(jiao)滿(man)一(yi)般(ban)半(ban)個(ge)平(ping)板(ban)就(jiu)夠(gou)用(yong),具(ju)體(ti)用(yong)量(liang)也(ye)根(gen)據(ju)菌(jun)種(zhong)的(de)不(bu)同(tong)有(you)所(suo)差(cha)異(yi),如(ru)黴(mei)菌(jun)、酵母菌在保存時,不適合用濁度法。
6、對於液體培養基培養的純菌,是否也可以用咱們的菌種保存管?如果可以的話,怎麼操作?
答:是shi可ke以yi用yong的de,如ru果guo液ye體ti培pei養yang基ji能neng保bao證zheng是shi純chun菌jun的de話hua,可ke以yi直zhi接jie離li心xin,棄qi掉diao上shang清qing,然ran後hou把ba保bao存cun管guan中zhong液ye體ti吸xi進jin去qu充chong分fen混hun勻yun,然ran後hou再zai轉zhuan移yi到dao菌jun種zhong保bao存cun管guan中zhong,整zheng個ge過guo程cheng要yao注zhu意yi無wu菌jun操cao作zuo。不bu過guo,一yi般ban菌jun種zhong保bao存cun管guan最zui好hao選xuan擇ze平ping板ban菌jun落luo進jin行xing保bao存cun,因yin為wei液ye體ti培pei養yang基ji中zhong有you雜za菌jun是shi不bu易yi觀guan察cha出chu來lai的de。
7、為什麼在菌種保存時,要上下顛倒?為什麼不能旋搖?
答:上下顛倒,可使菌懸液充分混勻,菌株充分、均勻地吸附到小瓷珠上,旋搖不利於菌懸液充分混勻,反而會使菌株全部沉澱於管底。
8、為什麼在使用時要將管內的液體盡可能多的吸出?
答:吸(xi)出(chu)液(ye)體(ti)可(ke)避(bi)免(mian)反(fan)複(fu)凍(dong)融(rong)形(xing)成(cheng)的(de)冰(bing)晶(jing)對(dui)菌(jun)株(zhu)的(de)損(sun)傷(shang),加(jia)快(kuai)複(fu)蘇(su)的(de)過(guo)程(cheng),因(yin)此(ci),要(yao)盡(jin)可(ke)能(neng)的(de)將(jiang)與(yu)菌(jun)種(zhong)混(hun)勻(yun)後(hou)的(de)保(bao)存(cun)液(ye)吸(xi)淨(jing)。而(er)常(chang)用(yong)的(de)甘(gan)油(you)法(fa),在(zai)複(fu)蘇(su)的(de)過(guo)程(cheng)中(zhong)需(xu)用(yong)水(shui)浴(yu)鍋(guo)快(kuai)速(su)溶(rong)解(jie),在(zai)此(ci)過(guo)程(cheng)中(zhong),對(dui)菌(jun)株(zhu)傷(shang)害(hai)較(jiao)大(da)。
9、在使用後,菌種保存管的保存環境?需要-80℃冰箱嗎?
答:本公司菌種保存管采用的是低溫冷凍保存法,因此,使用後,需放置低溫環境,如-20℃、-80℃或液氮中保存,而且溫度越低,保存效果越好。用戶需根據菌種的保存要求選擇具體保存溫度。
10、為什麼說,如果有條件的話,菌種保存管最好置於-80 冰箱或液氮中?
答:因為,貯存在-70℃以yi下xia低di溫wen中zhong能neng減jian少shao冰bing晶jing形xing成cheng,可ke極ji大da降jiang低di冰bing晶jing形xing成cheng對dui細xi菌jun的de傷shang害hai,同tong時shi可ke為wei被bei保bao存cun的de菌jun種zhong創chuang造zao更geng低di的de代dai謝xie環huan境jing,從cong而er延yan長chang細xi菌jun保bao存cun的de時shi間jian。
11、為什麼在取用菌株時,操作過程要求快速?
答:菌種保存複蘇的原則,要求慢凍快融,之所以要求快速,是因為在菌種複蘇的過程中, 長chang時shi間jian的de溶rong解jie過guo程cheng會hui對dui所suo保bao存cun的de菌jun種zhong造zao成cheng損sun傷shang,而er我wo們men經jing過guo改gai良liang的de保bao存cun方fang法fa最zui大da程cheng度du的de避bi免mian複fu蘇su所suo造zao成cheng的de影ying響xiang,但dan我wo們men還hai是shi建jian議yi遵zun循xun菌jun種zhong的de保bao存cun複fu蘇su原yuan則ze,保bao證zheng所suo複fu蘇su菌jun種zhong的de複fu蘇su率lv。
12、將菌株反複凍存,到底對菌株有什麼影響?
答:低di溫wen會hui使shi菌jun株zhu細xi胞bao內nei的de水shui分fen形xing成cheng冰bing晶jing,從cong而er引yin起qi細xi胞bao結jie構gou尤you其qi是shi細xi胞bao膜mo的de損sun傷shang。細xi胞bao體ti積ji大da者zhe一yi般ban要yao比bi較jiao小xiao者zhe對dui低di溫wen更geng為wei敏min感gan,而er無wu細xi胞bao壁bi者zhe則ze比bi有you細xi胞bao壁bi者zhe敏min感gan。如ru果guo放fang到dao低di溫wen(不是一般冰箱)進(jin)行(xing)冷(leng)凍(dong)時(shi),會(hui)產(chan)生(sheng)冰(bing)晶(jing),冰(bing)晶(jing)呈(cheng)針(zhen)狀(zhuang),極(ji)易(yi)導(dao)致(zhi)細(xi)菌(jun)的(de)嚴(yan)重(zhong)損(sun)傷(shang)。用(yong)電(dian)鏡(jing)觀(guan)察(cha),可(ke)見(jian)細(xi)菌(jun)的(de)核(he)膜(mo)上(shang)有(you)大(da)量(liang)針(zhen)尖(jian)樣(yang)小(xiao)孔(kong),當(dang)從(cong)低(di)溫(wen)下(xia)移(yi)出(chu)並(bing)開(kai)始(shi)升(sheng)溫(wen)時(shi),冰(bing)晶(jing)又(you)會(hui)變(bian)大(da),故(gu)反(fan)複(fu)凍(dong)存(cun),會(hui)對(dui)菌(jun)株(zhu)造(zao)成(cheng)極(ji)大(da)損(sun)傷(shang)。
13、為什麼有時候菌種的保存效果不佳?
答:1、可能是由於保存後未將保存液吸盡,反複凍融形成冰晶損傷菌株細胞,影響了菌株活性。
2、確定所保存的菌種是否為對數生長期的菌種,我們建議普通菌種保存為18小時內的新鮮菌種,而黴菌需要待孢子出現後保存其孢子。
14、該產品能否用於菌種的運送,如果可以在什麼條件下運送?
答:就目前試驗數據而言,我們建議可主要用於普通細菌的短期運送,對於厭氧菌在運送時最好讓其處於厭氧環境下,2-8℃運送不超過5 天。另外需要說明的是如弧菌屬和綠膿杆菌需要常溫運送,其對2-8℃溫度極其敏感。