不論傳統方法或現代檢測技術
，受檢測靈敏度的限製，食品樣本經前處理後多需經過增菌培養、選擇性分離後方可用於後續檢測分析。傳統微生物檢測中上述兩個步驟耗時長達24－96ｈ，為整個檢測流程中的關鍵限速步驟。因此，建立高效增菌策略以及靶標高度特異性微生物濃縮
、分離係統已成為實現微生物快速檢測的核心。

2.1 增菌條件優化

為了縮短增菌時間、提高檢測效率，國內外許多研究者致力於致病菌選擇性增菌條件改良。如通過單因素篩選、正交試驗設計優化了水產品中副溶血性弧菌的增菌培養基及培養條件，使其在相同培養時間內的菌液濃度達到國標增菌方法的1.8倍
；相對於通用的耗時48ｈ李氏增菌肉湯LB１和LB２兩步增菌法，美國學者研發了一步法ｏPＳＵ增(zeng)菌(jun)肉(rou)湯(tang)，適(shi)用(yong)於(yu)巴(ba)氏(shi)殺(sha)菌(jun)奶(nai)和(he)熱(re)狗(gou)等(deng)即(ji)食(shi)類(lei)食(shi)品(pin)中(zhong)單(dan)增(zeng)李(li)斯(si)特(te)菌(jun)的(de)快(kuai)速(su)檢(jian)測(ce)。此(ci)外(wai)，為(wei)了(le)滿(man)足(zu)當(dang)前(qian)食(shi)品(pin)致(zhi)病(bing)菌(jun)多(duo)重(zhong)化(hua)檢(jian)測(ce)的(de)需(xu)求(qiu)，在(zai)同(tong)一(yi)體(ti)係(xi)內(nei)實(shi)現(xian)多(duo)種(zhong)目(mu)標(biao)菌(jun)共(gong)增(zeng)菌(jun)的(de)富(fu)集(ji)培(pei)養(yang)基(ji)優(you)化(hua)也(ye)日(ri)益(yi)受(shou)到(dao)關(guan)注(zhu)。

如針對沙門氏菌、大腸杆菌O157：Ｈ7及單增李斯特菌的複合培養基SEL，經多重PCR及免疫法驗證了其良好的複合增菌效果。國內研究者通過優化也分別獲得了可同時富集沙門氏菌、金黃色葡萄球菌和大腸杆菌或單增李斯特菌的共增菌培養基，３種致病菌在優化條件下能以相對一致的速度增殖，增菌液可滿足下遊多重ＰＣＲ檢測要求
，有效提高了檢測效率。

2.2  細菌分離與濃縮

近年來，國內外學者開發了多種食源性致病菌的高效分離、濃縮法，基於其原理
，主要可分為包括離心
、過濾等在內的物理法和賴於免疫反應的吸附法。

2.2.1 密度梯度離心法

離心可將大體積樣本中的細菌經沉澱而濃縮，而後加入梯度密度的緩衝液，經多次的離心、洗滌最終實現細菌與食品基質的分離。

盡管離心法在細菌富集中具有一定的優勢，但其需經多次離心－洗滌反複循環而實現，耗時且影響濃縮效率
；另外，其濃縮對象為所有細菌，缺乏靶標特異性。相對於此，基於抗原－抗體免疫反應的吸附分離法則更顯優勢。

2.2.2 免疫磁分離技術

免疫磁分離技術是一種高效、teyixingweishengwufujijishu。qiyuanlizaiyuliyongcixingweiqiubiaomianouliandekangtiteyixingdixifuyangpinxishiyezhongdebabiaojun，erhouzaiyouzhibingweishengwudecixingkelizaiwaijiacichangdezuoyongxia
，xiangcijifangxiangjuji，qiqujianyanghunheye，shizhibingjundedaofenlihefuji
，congerdadasuoduanlechangguijiancesuoxuderongchangdezengjunshijian
，tigaojiancexiaolv。yiqigaodudebabiaoteyixingjiyuxiayoujiancejishudelianghaojianrongxingzaishipinweishengwukuaisujiancezhongdedaoguangfanyingyong。

快速檢測技術

傳統微生物檢測方法包括形態觀察、生化鑒定及血清學分型等冗繁的操作，已不能滿足現代食品微生物檢測對靈敏度、特異性和時效性的要求。

3.1 分子生物學方法

此類方法在基因水平上對靶標微生物進行檢測，尤其適用於難培養或抗原結構複雜微生物的鑒定及分型
，主要包括PCR、核酸分子雜交及基因芯片等技術。

3.1.1 PCR及其衍生技術

PCR是一種體外酶促合成特定DNA片段的技術
，它通過以變性、退火和延伸３個步驟為一個周期的循環反應實現產物的指數級增長。相對於擴增單一靶基因的常規PCR，多重PCRtongguozaitongyifanyingtixizhongjiaruduoduiteyixingyinwulaishixianzaitongyifanyingguanzhongtongshikuozengduogemubiaojiyin，keyongyutongshijianceduozhongweishengwuhuotongguoduojiyinjiaochaquerenlaijinxingtedingweishengwujiandinghuozhongxiafenxing。

實時熒光定量PCR技術是一種通過監測PCR產物熒光信號的實時累積來定性或定量分析起始模板的方法。該法全程封閉式反應且無需PCR後處理，避免了交叉汙染及溴化乙錠等有毒物質的使用
，具有特異性強
、高度自動化等優點。通過選取特異性基因設計引物及探針，ｑＲＴ－PCR法近年來已在多種致病細菌、黴菌
、酵母以及乳酸菌等重要食品微生物指標的定性和定量檢測中被廣泛應用。

盡管上述PCR及其衍生技術具有高靈敏度
、快速等優點，但方法實施所需的昂貴儀器設備嚴重限製了其在我國食品檢測機構的推廣應用。

3.1.2 核酸分子雜交技術

核酸分子雜交是利用帶有標記的特定DNA或RNA探tan針zhen與yu已yi變bian性xing的de待dai檢jian核he酸suan樣yang品pin進jin行xing雜za交jiao，若ruo樣yang品pin中zhong存cun在zai與yu探tan針zhen互hu補bu的de靶ba標biao序xu列lie則ze二er者zhe退tui火huo形xing成cheng帶dai標biao記ji的de雙shuang鏈lian，通tong過guo對dui標biao記ji物wu信xin號hao有you無wu及ji強qiang度du的de檢jian測ce即ji可ke實shi現xian微wei生sheng物wu定ding性xing或huo定ding量liang分fen析xi。 分fen子zi雜za交jiao技ji術shu應ying用yong的de關guan鍵jian在zai於yu靶ba標biao特te異yi性xing核he酸suan片pian段duan選xuan取qu及ji相xiang應ying探tan針zhen設she計ji及ji標biao記ji。如ru以yi葡pu糖tang苷gan酸suan酶mei基ji因yin設she計ji核he酸suan探tan針zhen可ke用yong於yu檢jian測ce食shi品pin中zhong的de總zong大da腸chang杆gan菌jun
，而er其qi不bu同tong致zhi病bing型xing的de區qu分fen則ze需xu針zhen對dui特te異yi毒du力li基ji因yin合he成cheng適shi宜yi的de探tan針zhen。由you於yu放fang射she性xing標biao記ji存cun在zai標biao記ji元yuan素su的de半ban衰shuai期qi短duan
、對人體及環境不友好以及需要特殊操作設備等缺陷，近年來已逐漸被非放射性DNA探針檢測係統所取代，其主要通過酶促反應將特定的底物轉變為生色物質或化學發光物質而達到信號放大的目的。

3.1.3 基因芯片

基因芯片又稱DNAweizhenlie，shiyizhonggaotongliangdehesuanfenzizajiaojishu。tatongguoyuanweihechenghuoxianweidayinjiangyixilietanzhenyiyushedecixugudingyuguxiangzhichijiezhibiaomian
，xingchenggaomidudeguahegansuanzhenlie，yangpinjinghesuantiqu、PCR擴kuo增zeng及ji標biao記ji後hou與yu芯xin片pian上shang的de探tan針zhen陣zhen列lie雜za交jiao
，最zui後hou通tong過guo熒ying光guang掃sao描miao或huo酶mei學xue方fang法fa檢jian測ce雜za交jiao信xin號hao的de強qiang度du和he分fen布bu以yi確que定ding受shou檢jian樣yang品pin中zhong特te定ding微wei生sheng物wu的de存cun在zai及ji豐feng度du。

食品中的微生物種群具有種類廣、豐度低

、隨機性強等特點，傳統的培養、鑒定方法往往會掩蓋一些低豐度或不易培養的微生物，而PCR、免疫雜交等現代技術則多限於檢測一種或少數幾種靶標微生物或基因，難以全麵分析食品受汙染狀況。而基因芯片具有高通量、並行化及高度自動化等優點
，為食品微生物群落結構研究
、食源性致病菌多個毒力、藥敏基因的同步化、快速檢測等提供了一個有力的平台。

3.2 免疫學方法

免疫學方法是基於抗原－抗kang體ti的de特te異yi性xing結jie合he反fan應ying發fa展zhan而er成cheng的de蛋dan白bai質zhi水shui平ping上shang的de係xi列lie檢jian測ce方fang法fa
，相xiang對dui於yu分fen子zi生sheng物wu學xue手shou段duan其qi更geng直zhi接jie地di靶ba向xiang微wei生sheng物wu特te異yi性xing基ji因yin的de表biao達da產chan物wu，在zai一yi定ding意yi義yi上shang更geng具ju說shuo服fu力li。

3.2.1 酶聯免疫吸附測定

 酶聯免疫吸附法是將抗原－抗體免疫反應的特異性與酶的高效催化作用有機地結合起來的一種固相酶免疫分析方法。相對於傳統ＥＬＩＳＡ的檢測限，通過單克隆抗體雙夾心法將海產品中副溶血性弧菌的檢測靈敏度提高了1000～10000倍；而以新型碳納米管作為固相吸附材料在沙門氏菌的ELISA檢測中亦取得了類似的效果。此外，許多學者還結合ＰＣＲ技術的倍增放大效果開發PCR－ELISA檢測技術，進一步提高檢測靈敏度。

酶聯熒光免疫分析技術則是近年來在ELISA基礎上發展而來的新型免疫熒光檢測技術。該技術用熒光底物代替生色底物， 提高了分析靈敏度，增寬測量範圍
，減少試劑的用量。Ｍｉｎｉ－ＶＩＤＡＳ即是法國梅裏埃公司根據上述原理開發的一款全自動酶聯免疫熒光儀，實現了雙抗夾心的ELISA技術的自動化。

3.2.2 免疫層析技術

免疫層析將免疫反應和層析原理相結合， 借助毛細管作用使樣品在條狀纖維製成的膜上泳動， 其中的待測物與膜上一定區域的配體發生高特異性、高親和性的免疫結合， 通過酶促顯色反應或直接使用著色標記物
， 在短時間（20min內）便可得到直觀的結果。

suizhejiancejishudebuduanfazhan，mianyicengxishizhiyebuduanyingyongyuzhibingjundinglianghuajiance。ciwai，zaitongyimianyicengxishizhitiaoshangjinxingduozhongshipinzhibingjuntongbujiancedefangfayezhengzhububeikaifa。tongguobutongguangxinhaobiaoji

3.2.3 乳膠凝集反應

乳膠凝集反應采用人工大分子乳膠顆粒標記抗體， 使(shi)之(zhi)與(yu)待(dai)測(ce)抗(kang)原(yuan)發(fa)生(sheng)肉(rou)眼(yan)可(ke)見(jian)的(de)凝(ning)集(ji)反(fan)應(ying)，以(yi)達(da)到(dao)檢(jian)測(ce)目(mu)標(biao)病(bing)原(yuan)微(wei)生(sheng)物(wu)或(huo)毒(du)素(su)的(de)目(mu)的(de)。基(ji)於(yu)乳(ru)膠(jiao)凝(ning)集(ji)檢(jian)測(ce)法(fa)的(de)高(gao)靈(ling)敏(min)度(du)和(he)特(te)異(yi)性(xing)以(yi)及(ji)結(jie)果(guo)直(zhi)觀(guan)性(xing)
、操作簡易度等優勢
，近年來其在食源性致病菌檢測中的應用越發廣泛。

3.3 代謝學方法

代謝學方法是指基於微生物在生理代謝過程中發生的特異性物理、化學變化而設計的一係列檢測手段，主要包括電阻抗法、ATP發光法和微量生化法等。

3.3.1 阻抗法

阻(zu)抗(kang)法(fa)是(shi)一(yi)種(zhong)通(tong)過(guo)檢(jian)測(ce)細(xi)菌(jun)在(zai)生(sheng)長(chang)繁(fan)殖(zhi)時(shi)將(jiang)電(dian)惰(duo)性(xing)生(sheng)物(wu)大(da)分(fen)子(zi)代(dai)謝(xie)為(wei)帶(dai)電(dian)荷(he)的(de)活(huo)性(xing)小(xiao)分(fen)子(zi)所(suo)引(yin)起(qi)的(de)培(pei)養(yang)液(ye)電(dian)阻(zu)和(he)電(dian)導(dao)的(de)變(bian)化(hua)來(lai)定(ding)量(liang)表(biao)征(zheng)微(wei)生(sheng)物(wu)的(de)新(xin)型(xing)檢(jian)測(ce)方(fang)法(fa)。該(gai)法(fa)因(yin)具(ju)有(you)高(gao)敏(min)感(gan)性(xing)
、特異性、反應快速性以及可重複性等優點而在食品微生物快速檢測中被廣泛應用。

3.3.2  ATP生物發光法

ATP作為機體的“能量貨幣”普遍存在於所有活體生物中且含量相對恒定，其隨機體死亡亦會被快速分解

，因此測定樣品中的ATP濃度即可推算出其攜帶的活菌數。基於此，ATP發光法通過發光光度計檢測熒光素酶在ATP的作用下氧化熒光素所產生的熒光強度
，並利用其在一定範圍內與ATP濃度的線性關係來定量樣品中的ATP含量，繼而推算係統中代謝活細胞水平。

該(gai)方(fang)法(fa)無(wu)需(xu)對(dui)樣(yang)本(ben)中(zhong)的(de)微(wei)生(sheng)物(wu)進(jin)行(xing)培(pei)養(yang)
，可(ke)在(zai)數(shu)分(fen)鍾(zhong)內(nei)完(wan)成(cheng)檢(jian)測(ce)，且(qie)熒(ying)光(guang)光(guang)度(du)計(ji)小(xiao)巧(qiao)便(bian)攜(xie)，尤(you)其(qi)適(shi)用(yong)於(yu)大(da)批(pi)量(liang)食(shi)品(pin)樣(yang)本(ben)細(xi)菌(jun)汙(wu)染(ran)狀(zhuang)況(kuang)以(yi)及(ji)食(shi)品(pin)加(jia)工(gong)設(she)備(bei)清(qing)潔(jie)度(du)的(de)現(xian)場(chang)快(kuai)速(su)檢(jian)定(ding)。如(ru)自(zi)動(dong)ATP生物熒光技術已在歐洲和北美的乳品工業中廣泛應用於生乳活菌數檢測
、UHT乳活菌數檢測
、設備清潔度的評估及成品架售期的推算等。

3.3.3  微量生化法

為了滿足食品微生物快速化、標準化、批量化檢測的需求，目前市場上出現了許多高精密度、高重現性的商品化微量生化鑒定試劑盒，大大提高了檢測速率以及結果的重現性。

盡(jin)管(guan)上(shang)述(shu)試(shi)劑(ji)盒(he)已(yi)大(da)大(da)簡(jian)化(hua)了(le)傳(chuan)統(tong)微(wei)生(sheng)物(wu)生(sheng)化(hua)鑒(jian)定(ding)程(cheng)序(xu)，但(dan)其(qi)不(bu)同(tong)反(fan)應(ying)仍(reng)需(xu)分(fen)別(bie)加(jia)樣(yang)且(qie)結(jie)果(guo)依(yi)賴(lai)人(ren)工(gong)判(pan)讀(du)。近(jin)年(nian)來(lai)隨(sui)著(zhe)檢(jian)測(ce)科(ke)學(xue)的(de)不(bu)斷(duan)發(fa)展(zhan)，全(quan)自(zi)動(dong)微(wei)生(sheng)物(wu)生(sheng)化(hua)鑒(jian)定(ding)分(fen)析(xi)係(xi)統(tong)也(ye)應(ying)運(yun)而(er)生(sheng)，通(tong)過(guo)結(jie)合(he)現(xian)代(dai)計(ji)算(suan)機(ji)技(ji)術(shu)，該(gai)係(xi)統(tong)可(ke)在(zai)一(yi)次(ci)加(jia)樣(yang)後(hou)自(zi)動(dong)完(wan)成(cheng)係(xi)列(lie)生(sheng)化(hua)檢(jian)測(ce)並(bing)通(tong)過(guo)概(gai)率(lv)最(zui)大(da)近(jin)似(si)值(zhi)模(mo)型(xing)法(fa)分(fen)析(xi)後(hou)直(zhi)接(jie)報(bao)告(gao)鑒(jian)定(ding)結(jie)果(guo)。上(shang)述(shu)自(zi)動(dong)生(sheng)化(hua)鑒(jian)定(ding)係(xi)統(tong)可(ke)在(zai)４－６ｈ內同時完成數十個樣品的分析

，可滿足批量化鑒定的需求，且與其他檢測方法的結果高度吻合。