蛋dan白bai質zhi糖tang基ji化hua是shi生sheng命ming係xi統tong非fei常chang重zhong要yao的de翻fan譯yi後hou修xiu飾shi之zhi一yi，在zai免mian疫yi識shi別bie，蛋dan白bai分fen泌mi，信xin號hao轉zhuan導dao等deng生sheng命ming過guo程cheng中zhong發fa揮hui了le重zhong要yao作zuo用yong。與yu蛋dan白bai相xiang連lian的de多duo聚ju糖tang是shi這zhe些xie功gong能neng的de重zhong要yao載zai體ti，特te別bie是shi對dui於yu單dan克ke隆long抗kang體ti藥yao物wu，多duo聚ju糖tang部bu分fen對dui藥yao物wu的de生sheng物wu活huo性xing有you著zhe重zhong要yao的de影ying響xiang。因yin此ci
，發fa展zhan分fen離li效xiao率lv高gao
，檢jian測ce靈ling敏min度du好hao的de糖tang基ji化hua分fen析xi方fang法fa對dui單dan克ke隆long抗kang體ti藥yao物wu分fen析xi具ju有you十shi分fen重zhong要yao的de意yi義yi。

 

針對糖基化分析中的種種困難，沃特世公司開發了親水作用色譜法，以及熒光-質譜結合檢測的分析方法。ACQUITY UPLC係統配合熒光檢測器?(FLR)以及多聚糖分析專用(GST )色譜柱，比HPLC方法有更高的分離度。多聚糖分析專用色譜柱裝填了1.7μm的酰胺吸附劑，可在HILIC模式下有效分離熒光標記的多聚糖。UPLC配合熒光檢測器®分析多聚糖可以獲得很高的分離度和定量準確性

，特別是對於位置異構體以及有共流出的小峰分析；erzhipujianceweitanglianjiandingtigonglegengduodejiegouxinxi。tongguoyubiaozhuntanglianbaoliushijiandebijiao
，gailiuchengnengshixiangaotongliangdeduojutangdingxingdingliang
，manzuyaowufenxideduozhongxuqiu。
 

一
、色譜條件與標記後的多聚糖樣品的分離

可通過HILIC方法
，有效分離2-AB標記的多聚糖混合物。對於方法優化
，使用更緩的窄梯度
，可有效提高保留時間上相臨近的多聚糖峰之間的分離度
；對於其它的參數，如流速
、緩衝液濃度
、流動相pH及柱溫等，一般也需要進行優化。圖1示例使用優化後的HILIC色譜條件後
，複雜的2-AB標記的IgG多聚糖混合物得到了很好的分離
，包括E1/ E2與F1/ F2。實驗所用梯度洗脫時間為45分鍾，包括色譜柱清洗和再平衡步驟。一般來說，一個樣品的總分析時間在1小時內。因此，與使用3.0-μm填料的HPLC方法相比
，使用1.7-μm填料的UPLC色譜方法
，不但分離效果更好，而且運行時間更短。實驗中使用2.1 x150 mm色譜柱。圖1(B)中甘露糖5(峰C)與甘露糖6(峰H)可與鄰近多聚糖峰成功分離，解決了共流出的問題。

二
、2-AB標記的多聚糖定量及結構鑒定

由於多聚糖在HILIC moshixianengshixianjixianfenli，gezhongyigouti，lirumoduantuoyesuandeweizhiyigou，dounengdedaohenhaodefenli。yinci，zaiyingguangjianceqixiadefengmianjijifennengduigezhongtanglianjinxingdingliangfenxi。ercongMS譜(pu)圖(tu)來(lai)看(kan)，多(duo)聚(ju)糖(tang)樣(yang)品(pin)中(zhong)高(gao)甘(gan)露(lu)糖(tang)糖(tang)型(xing)所(suo)占(zhan)比(bi)例(li)較(jiao)高(gao)，而(er)複(fu)合(he)型(xing)及(ji)雜(za)合(he)型(xing)糖(tang)鏈(lian)也(ye)都(dou)能(neng)夠(gou)得(de)到(dao)鑒(jian)定(ding)。各(ge)種(zhong)帶(dai)有(you)神(shen)經(jing)氨(an)酸(suan)的(de)糖(tang)鏈(lian)也(ye)都(dou)能(neng)得(de)到(dao)鑒(jian)定(ding)，表(biao)明(ming)該(gai)方(fang)法(fa)能(neng)夠(gou)適(shi)合(he)各(ge)種(zhong)多(duo)聚(ju)糖(tang)複(fu)合(he)物(wu)的(de)分(fen)析(xi)。除(chu)了(le)分(fen)子(zi)量(liang)，我(wo)們(men)還(hai)能(neng)通(tong)過(guo)MS/MS譜圖進一步確認多聚糖的結構。

 

2-AB標記的IgG多聚糖混合物的分析結果充分說明沃特世提供了成熟的聚糖分析方案
，且相應色譜柱的質量控製采用了2-AB標記的IgG多聚糖混合物進行。ACQUITYUPLC係統顯著縮短了分析時間

，將常規HPLC上需要2個小時甚至3個小時的分離梯度縮短到1小時。 此外沃特世提供UPLC-FLR-MSdezhengtijiejuefangankeyishifenyouxiaodeduiduojutangjinxingfenxi，chutigongfenziliangxinxiwai
，haikeyijinxingtangjiegoutuidao
，dadajiangdileshengwuyaowuyanfagongzuozhongtangjihuafenxidenandu。
 

一、2-AB 標記糖鏈

使用GlycoPro  le試劑盒
，Prozyme公司

使用試劑盒進行2-AB 標記糖鏈時，除以下步驟，按照該公司的說明操作即可。

1.使用50μl的標記反應液

2. 65度反應4-5小時

3.將樣品按步驟4處理除掉過量的標記試劑

 

使用Sigma公司試劑

1. 配製3 0% 的醋酸D M S O 溶液（ 3 0 μ l 冰醋酸，700ulDMSO）

2.按照20：1（v/w）的比例配製2-AB 溶液 （如需要20mg 2-AB，則用400μl 30% 的醋酸DMSO溶液配製）

3.以16.7：1（v/w）的比例將2-AB溶液與氰基硼氫化鈉混合配製標記反應液

4.將所得糖鏈用50μl標記反應液溶解，65度震蕩反映4-5小時

5 .將反應液按步驟4處理除去過量的標記試劑
 

二
、使用MassPrep親水作用樣品處理板除去過量的標記試劑

所需溶液: MiniQ 純水，90% 乙腈 ACN，10 mM 醋酸銨Tris
，20% ACN

1.樣品處理板活化，向樣品處理板加入200μl MiniQ純水

，再加入 200μl 90% ACN，重複 90% ACN

2.吸取 50μl 標記溶液，加入 450μl ACN（ 如有沉澱，請勿離心
，以免降低糖鏈回收率），由於板上每孔體積為200μl
，可以將樣品分為四份加入

3.將樣品加入處理板，設定真空度為低（壓力 250-500 mmHg）
，以保證樣品與HILIC基質有充分時間相互作用

；如果溶液在板上沒有移動
，可適當增加真空度

4.用 90% ACN清洗處理板兩次

5.換用樣品收集板，用200μl 10 mM 醋酸銨Tris， 20%ACN洗脫，洗脫液轉移至1ml 離心管

6.冷凍幹燥標記後糖鏈溶液凍幹後的樣品複溶於20μl50% ACN中
，超聲5 min 後轉入UPLC采樣瓶，進樣5μl。

 

參考文獻

(1) Martin Gilar, Ying-Qing Yu, Joomi Ahn, and Hongwei Xie.Analysis of Glycopeptide Glycoforms in Monoclonal Antibody TrypticDigest using a UPLC HILIC Column

(2) Hongwei Xie, Weibin Chen, Martin Gilar, St John Skiltonand Jeffery R. Mazzeo. Separation and Characterization of N-linkedGlycopeptides on Hemagglutinins In A Recombinant Influenza Vaccine

(3) Joomi Ahn，Ying Qing Yu and Martin Gila.r UPLC親水相互作用色譜(HILIC)-熒光檢測法分析2-AB標記的多聚糖