15種蛋白質單晶培養的方法：

（1）大量養晶法（bulk crystallization）：若急著養出單晶，則將純化之蛋白質溶液加入固體鹽類或飽和鹽液
，直到溶液中出現乳白混濁色，離心後把上清液（suppernatant）放置數天至數周，有可能養出單晶。

（2）批次養晶法（batch method）:若發現加入蛋白質的沉澱劑和鹽類等化學藥品，在濃度C1產生沉澱

，濃度Cn為液體，則在C1至Cn之間細分成一串濃度C1>C2>C3>….>Ci>Cn，（n-2）個小試管進行養晶

，可能結出單晶。此法之主要缺點在於蛋白質的消耗量大。

（3）大量透析法（bulk dialysis）：把蛋白質溶液包在半透膜（membrane）內，浸入盛有化學藥品的器皿中
，半透膜能讓小分子進出
，卻不會讓蛋白質等大分子通過，則器皿中沉澱劑、鹽類和有機溶液等化學藥品會穿過半透膜，與蛋白質起作用，直到膜之內外的濃度梯度（concentration gradient）降到零為止。此法的好處在於
，器皿中化學藥品之濃度可作連續之調整，pH值的範圍也可探討。壞處是膜之內外濃度差異減少時
，平衡速率也隨之降低。

（4）微量透析法（microdialysis）:把(ba)半(ban)透(tou)膜(mo)的(de)體(ti)積(ji)縮(suo)小(xiao)，綁(bang)在(zai)比(bi)鈕(niu)扣(kou)略(lve)大(da)的(de)襯(chen)架(jia)上(shang)，架(jia)體(ti)之(zhi)凹(ao)槽(cao)內(nei)注(zhu)入(ru)蛋(dan)白(bai)質(zhi)溶(rong)液(ye)
，包(bao)覆(fu)半(ban)透(tou)膜(mo)的(de)體(ti)架(jia)放(fang)入(ru)盛(sheng)有(you)化(hua)學(xue)藥(yao)品(pin)的(de)器(qi)皿(min)，其(qi)養(yang)晶(jing)原(yuan)理(li)與(yu)大(da)量(liang)透(tou)析(xi)法(fa)相(xiang)同(tong)，隻(zhi)是(shi)使(shi)用(yong)蛋(dan)白(bai)質(zhi)和(he)化(hua)學(xue)藥(yao)品(pin)的(de)量(liang)放(fang)得(de)少(shao)。注(zhu)意(yi)凹(ao)槽(cao)內(nei)不(bu)得(de)留(liu)有(you)氣(qi)泡(pao)，否(fou)則(ze)膜(mo)外(wai)的(de)化(hua)學(xue)藥(yao)品(pin)為(wei)氣(qi)泡(pao)所(suo)阻(zu)止(zhi)而(er)無(wu)法(fa)透(tou)過(guo)氣(qi)泡(pao)，滲(shen)入(ru)膜(mo)內(nei)的(de)蛋(dan)白(bai)質(zhi)溶(rong)液(ye)。

（5）連續萃取（sequential extraction）：此法所根據的原理是亞可比（Jacoby）的實驗
，他發現蛋白質在硫酸銨溶液中溶解度隨溫度的提升而下降。在4℃以下取得上清液（supernatant）
，放在室溫長晶。先將蛋白質溶液加入固體硫酸銨或飽和硫酸銨液體，使蛋白質溶液沉澱，離心除去上清液。接著保持4℃以下處理一係列的蛋白質沉澱物。準備數種依次遞降濃度的沉澱劑（通常為蒸餾水），nongdugaodechendianjixianjiarushangshudanbaizhichendianwuzhong，yibobangjiaobanbinglixin
，quchushangqingye

，fangzaishiwenyangjing，zaibanongducigaodechendianjijiarushangciweiwanquanrongjiededanbaizhichendianwu，jiaobanlixin
，bashangqingyezhiyushiwenyangjing，yicileitui，zhidaodanbaizhiquanburongjieweizhi。zheyangmeiciquchudedanbaizhinongduyicidijian
，rongyeyoudiwenyizhigaowen
，fuheyakebidezhunze
，kenengyangchudanbaizhidanjing。

（6）自由接口間的擴散法（free interface diffusion）：若蛋白質在不同的溶劑中具有不同的溶解度
，則蛋白質注入盛有沉澱劑試管的上方或下方（依密度而定
，密度大者放在下方），在兩種溶液的交界麵擴散會有晶核長出
，裝置如圖7-10所示。

（7）凹盤或玻片上的蒸汽擴散法（vapor diffusion on plates or slides）—座滴法：danbaizhiyangjingdeyaolingzaiyudanbaizhidachengguobaoherongye，tongshitianjiadehuaxueyaowuyudanbaizhiqizuoyong，xiezhujinghedexingcheng。chanyouhuaxueyaopindedanbaizhirongye
，qishuifenmanmankuosan，dadaoguobaoherongyezeyoukenengchangchudanjing。ruodanbaizhirongyebaoluzaikongqizhong，shuifenzhengfadiao，zedanbaizhiganhe，wufaxingchengdanjing

，yuanyinshidanbaizhidanjingyuelveweichiyetaidejiegou
，hanyoudaliangshuifen，shuifenyudanbaizhijianxingchengxuduoqingjian
，shuifenzhengfa
，danbaizhiyewuyiweixi
，yincibixubaochishuifen，shidanbaizhirongyemibizaiyigerongqizhong。tongshihaidetiaojieshuifen
，suoyibixuzhifangliangzhongrongye
，shidanbaizhirongyezhongdeshuifenkuosandaolingyizhonggaonongduderongyezhong

，yidadanbaizhirongyedeguobaohe。tongchangxuanzeshidangdeyanleiheyoujirongji

，tiaozaidengdiandiandepH值，形成沉澱劑
，把粉晶蛋白質泡成一定濃度，約在5～40mg/ml之間，在凹盤的下凹孔鍍矽
，注入一些蛋白質溶液和沉澱劑總共10～40 m l。在凹盤外方的塑料盒，倒入20～30ml的沉澱劑。在塑料的四周塗真空油膏（Vacuum grease），加以密封。通常這樣的塑料盒對於每種養晶條件製備兩盒，一盒放在4℃的(de)低(di)溫(wen)，另(ling)盒(he)放(fang)在(zai)室(shi)溫(wen)，待(dai)其(qi)長(chang)晶(jing)
，快(kuai)則(ze)一(yi)周(zhou)
，慢(man)則(ze)數(shu)月(yue)，幸(xing)運(yun)的(de)話(hua)，可(ke)望(wang)長(chang)出(chu)單(dan)晶(jing)。通(tong)常(chang)一(yi)次(ci)製(zhi)備(bei)數(shu)拾(shi)條(tiao)件(jian)，大(da)量(liang)養(yang)晶(jing)。要(yao)鑒(jian)定(ding)長(chang)出(chu)的(de)單(dan)晶(jing)確(que)實(shi)是(shi)蛋(dan)白(bai)質(zhi)而(er)不(bu)是(shi)滴(di)入(ru)的(de)沉(chen)澱(dian)劑(ji)等(deng)化(hua)學(xue)藥(yao)品(pin)。若(ruo)養(yang)出(chu)蛋(dan)白(bai)質(zhi)單(dan)晶(jing)太(tai)小(xiao)，不(bu)足(zu)以(yi)供(gong)X光繞射實驗使用
，則可使用連續播種法把小晶粒養大：依照養出蛋白質小單晶的條件，炮製母液（蛋白質溶液配合沉澱劑）
，注(zhu)入(ru)凹(ao)孔(kong)，外(wai)圍(wei)倒(dao)注(zhu)沉(chen)澱(dian)劑(ji)，加(jia)以(yi)密(mi)封(feng)，等(deng)待(dai)約(yue)半(ban)天(tian)後(hou)，打(da)開(kai)封(feng)蓋(gai)
，把(ba)以(yi)前(qian)所(suo)養(yang)的(de)小(xiao)晶(jing)粒(li)稍(shao)加(jia)清(qing)洗(xi)後(hou)放(fang)入(ru)

，企(qi)圖(tu)長(chang)大(da)，若(ruo)長(chang)出(chu)的(de)晶(jing)體(ti)仍(reng)然(ran)不(bu)符(fu)X光使用，則把最後一次的晶體當新晶種，再繼續播種，直到晶體夠大。此種養晶法的好處是：用量少，篩選多種條件相當理想;易於修飾塑料盒內沉澱劑的濃度。此種養晶法裝置，也可用具有凹槽的玻片來取代，在其一凹孔注入10m l的母液，另一凹孔注入20～40m l的沉澱劑

，以小玻片密封，等待長晶。 

（8）懸滴液蒸汽擴散法（vapor diffusion in hanging drops）—懸滴法: 它(ta)在(zai)原(yuan)理(li)上(shang)和(he)座(zuo)滴(di)法(fa)相(xiang)同(tong)，皆(jie)以(yi)蒸(zheng)汽(qi)達(da)到(dao)平(ping)衡(heng)，利(li)用(yong)少(shao)量(liang)蛋(dan)白(bai)質(zhi)篩(shai)選(xuan)多(duo)種(zhong)養(yang)晶(jing)條(tiao)件(jian)。此(ci)法(fa)用(yong)量(liang)比(bi)座(zuo)滴(di)液(ye)更(geng)少(shao)。在(zai)方(fang)形(xing)或(huo)圓(yuan)形(xing)的(de)玻(bo)片(pian)上(shang)鍍(du)矽(gui)
，滴(di)入(ru)少(shao)於(yu)10m l的蛋白質母液
，在培養皿的每一凹槽中注入1 ml的沉澱劑，把方形玻片翻轉，蓋在凹槽孔緣，加以密封，形成懸滴液，進行擴散，蛋白質溶液達到過飽和，長出單晶。

（9）液體橋連法（liquid bridge）如圖7-12（b）所suo示shi
，一yi小xiao滴di母mu液ye和he一yi滴di沉chen澱dian液ye分fen別bie滴di在zai玻bo璃li片pian的de兩liang靠kao近jin處chu，以yi細xi針zhen引yin導dao細xi橋qiao相xiang接jie
，把ba此ci載zai有you液ye滴di的de玻bo片pian放fang在zai密mi封feng容rong器qi中zhong，在zai細xi橋qiao相xiang連lian處chu可ke望wang長chang出chu單dan晶jing。（10）濃度透析法（concentration dialysis）：，離li子zi強qiang度du弱ruo
，則ze蛋dan白bai質zhi溶rong解jie度du低di

，易yi形xing成cheng晶jing核he，長chang出chu單dan晶jing，可ke利li用yong氮dan氣qi在zai裝zhuang有you蛋dan白bai質zhi和he鹽yan類lei的de透tou析xi袋dai內nei施shi壓ya，使shi鹽yan類lei穿chuan透tou透tou析xi膜mo流liu出chu
，降jiang低di袋dai內nei鹽yan類lei濃nong度du，使shi蛋dan白bai質zhi溶rong液ye在zai低di離li子zi強qiang度du下xia長chang出chu單dan晶jing。

（11）pH引導長晶法（crystallization induced by pH）：蛋白質的溶解度在等電點的pH值最低，是個良好的養晶條件。有些蛋白質在不同的數個pH值，具有數個溶解度的極小，這些溶解度極小處可望長晶。利用透析法改變透析膜外的pH值是個好辦法。也可在蒸汽擴散法中
，在外圍滴入揮發性酸或堿（如氨水或幹冰等）來調節pH值。

（12）溫度長晶法（temperature crystallization）：蛋白質溶解度為溫度的函數
，有些溶解度非常溫度敏感。通常溫度降低，分子排列較有秩序
，引起能趨疲（熵）（entropy）的(de)降(jiang)低(di)。由(you)液(ye)體(ti)轉(zhuan)變(bian)到(dao)固(gu)體(ti)
，其(qi)熵(shang)會(hui)降(jiang)低(di)，反(fan)之(zhi)亦(yi)然(ran)。井(jing)然(ran)有(you)序(xu)排(pai)列(lie)的(de)分(fen)子(zi)易(yi)於(yu)長(chang)晶(jing)。通(tong)常(chang)一(yi)種(zhong)長(chang)晶(jing)條(tiao)件(jian)泡(pao)兩(liang)份(fen)，一(yi)份(fen)置(zhi)於(yu)室(shi)溫(wen)，另(ling)一(yi)份(fen)放(fang)在(zai)4℃的冰箱。

（13）蒸發（evaporation）：zheshizuiyuanshidefangfa，weixiaofenzidechangjingchangyongfa
，yeshimouxiedanbaizhichangyongdeyangjingfa。zaidanbaizhibubianxingdetiaojianxia，manmanrangmuyezhengfa，shidanbaizhirongyedadaoguobaohe，jiechudanjing。

（14）填加有效分子法（effector addition）：與有效分子（effector）結合的蛋白質，其溶解度往往與無有效分子結合者差異大，可達到某些構象（conformation）平衡狀態的存在，養出此種構象單晶，通常的有效分子有配位體（ligand）和基質（substrate）等。

（15）對蒸餾水透析法（dialysis against water）：離(li)子(zi)強(qiang)度(du)弱(ruo)則(ze)蛋(dan)白(bai)質(zhi)溶(rong)解(jie)度(du)低(di)，以(yi)半(ban)透(tou)膜(mo)裝(zhuang)母(mu)液(ye)
，外(wai)浸(jin)蒸(zheng)餾(liu)水(shui)，鹽(yan)類(lei)往(wang)膜(mo)外(wai)透(tou)出(chu)，待(dai)膜(mo)內(nei)蛋(dan)白(bai)質(zhi)溶(rong)解(jie)度(du)降(jiang)低(di)，可(ke)望(wang)長(chang)出(chu)單(dan)晶(jing)。此(ci)法(fa)相(xiang)當(dang)有(you)效(xiao)，值(zhi)得(de)首(shou)次(ci)嚐(chang)試(shi)。前(qian)提(ti)是(shi)蛋(dan)白(bai)質(zhi)不(bu)得(de)變(bian)性(xing)（denature）
，有時添加少許 [0.02%（w/v）] 的 Sodium azide，或數滴甲苯（toluene）或氯仿（chloroform）有助防止細菌的滋長