通過結晶紫初染和碘液媒染後，在細胞壁內形成了不溶於水的結晶紫與碘的複合物，革蘭氏陽性菌由於其細胞壁較厚、肽tai聚ju糖tang網wang層ceng次ci較jiao多duo且qie交jiao聯lian致zhi密mi
，故gu遇yu乙yi醇chun脫tuo色se處chu理li時shi，因yin失shi水shui反fan而er使shi網wang孔kong縮suo小xiao，再zai加jia上shang它ta不bu含han類lei脂zhi，故gu乙yi醇chun處chu理li不bu會hui出chu現xian縫feng隙xi，因yin此ci能neng把ba結jie晶jing紫zi與yu碘dian複fu合he物wu牢lao牢lao留liu在zai壁bi內nei，使shi其qi仍reng呈cheng紫zi色se

；而革蘭氏陰性菌因其細胞壁薄、外膜層類脂含量高
、肽(tai)聚(ju)糖(tang)層(ceng)薄(bo)且(qie)交(jiao)聯(lian)度(du)差(cha)，在(zai)遇(yu)脫(tuo)色(se)劑(ji)後(hou)，以(yi)類(lei)脂(zhi)為(wei)主(zhu)的(de)外(wai)膜(mo)迅(xun)速(su)溶(rong)解(jie)，薄(bo)而(er)鬆(song)散(san)的(de)肽(tai)聚(ju)糖(tang)網(wang)不(bu)能(neng)阻(zu)擋(dang)結(jie)晶(jing)紫(zi)與(yu)碘(dian)複(fu)合(he)物(wu)的(de)溶(rong)出(chu)
，因(yin)此(ci)通(tong)過(guo)乙(yi)醇(chun)脫(tuo)色(se)後(hou)仍(reng)呈(cheng)無(wu)色(se)，再(zai)經(jing)番(fan)紅(hong)等(deng)紅(hong)色(se)染(ran)料(liao)複(fu)染(ran)，就(jiu)使(shi)革(ge)蘭(lan)氏(shi)陰(yin)性(xing)菌(jun)呈(cheng)紅(hong)色(se)。
 

二
、步驟
 

  革蘭氏染色法的步驟為：塗片→固定→結晶紫色染色→水洗→碘液媒染→水洗→酒精脫色→番紅複染→水洗→幹燥→觀察。

1、塗片 

  首(shou)先(xian)在(zai)載(zai)玻(bo)片(pian)上(shang)滴(di)一(yi)小(xiao)滴(di)蒸(zheng)餾(liu)水(shui)
，用(yong)灼(zhuo)燒(shao)過(guo)的(de)接(jie)種(zhong)針(zhen)挑(tiao)取(qu)少(shao)量(liang)細(xi)菌(jun)，置(zhi)於(yu)載(zai)玻(bo)片(pian)的(de)水(shui)滴(di)中(zhong)與(yu)水(shui)混(hun)合(he)並(bing)塗(tu)抹(mo)開(kai)。注(zhu)意(yi)塗(tu)抹(mo)要(yao)均(jun)勻(yun)平(ping)坦(tan)，塗(tu)抹(mo)成(cheng)直(zhi)徑(jing)約(yue)為(wei)1 cm的薄層。　

2、固定

  將載玻片在火焰上方快速來回通過一兩次，以載玻片的加熱麵接觸手背皮膚，不覺過燙為佳；待冷卻後再在火焰上方來回通過一兩次
，再冷卻
，重複操作直到薄層變幹。

3、結晶紫染色 

  染色1分鍾，然後水洗並用吸水紙吸幹。

  碘液媒染 染色1分鍾，然後水洗並吸幹。

4、酒精脫色

  用95%酒精脫色

，直到酒精不出現紫色時即停止（大約半分鍾）
，然後立即水洗，並吸幹。

5、番紅複染 

  染色3分鍾左右
，然後水洗並吸幹。

6、鏡檢

  在顯微鏡油鏡頭下觀察，菌體顯藍紫色的為革蘭氏陽性菌；菌體顯紅色的為革蘭氏陰性菌。
 

三
、結果
 

  染色結果革蘭氏陽性菌呈藍紫色，革蘭氏陰性菌呈紅色。

四
、意義

1、鑒別細菌 

2

、選擇藥物 

3、與致病性有關

  革蘭氏陽性菌能產生外毒素，革蘭氏陰性菌能產生內毒素；而內毒素主要是指革蘭氏陰性菌胞壁成分中的脂多糖

，兩者的致病作用不同。
 

五
、注意事項
 

1、注意塗片不宜過厚
，勿使細菌密集重疊，影響脫色效果，否則脫色不完全造成假陽性。鏡檢時應以視野內分散細胞的染色反應為標準。

2、火焰固定溫度要適宜，以玻片不燙手為宜
，否則菌體細胞變性。

3
、滴加染色液與酒精時一定要覆蓋整個菌膜，否則部分菌膜未受處理
，亦可造成假象。

4、乙醇脫色是革蘭氏操作的關鍵環節。如脫色過度，則G+被誤染成G-菌
，而脫色不足，G-被誤染成G+菌。在染色方法正確無誤的前提下，如菌齡過長、死亡或細胞壁受損傷的G+也會呈陰性反應，故革蘭氏染色用要對數生長期的幼齡培養物。

5
、染色過程的時間控製。應根據季節、氣溫調整。一般冬季時間可稍微長些，夏季可稍微短些。