革蘭氏染色的差異源於細菌細胞壁結構和化學成分的不同。

革蘭氏陽性菌（G⁺）：細胞壁厚，富含肽聚糖和磷壁酸，結構致密。在經過乙醇或丙酮脫色時
，肽聚糖層脫水收縮，使得結晶紫-碘複合物被牢牢鎖在細胞壁內，不易被洗脫，因此最終呈現紫色或藍色。

革蘭氏陰性菌（G⁻）：細胞壁薄，肽聚糖層較薄
，但外膜含有豐富的脂多糖和脂質。脫色劑能溶解外膜的脂質，破壞細胞壁完整性，形成孔隙，從而使結晶紫-碘複合物極易被洗脫。當複染劑沙黃或品紅加入後
，細胞便被染成紅色或粉色。

1、菌種：待測細菌的新鮮培養物（通常為18-24小時菌齡）。

2、載玻片、接種環、酒精燈
、洗瓶、顯微鏡。

3


、四種關鍵試劑（按使用順序）：

初染劑：結晶紫（Crystal Violet）

媒染劑：路哥氏碘液（Lugol's Iodine）

脫色劑：95%乙醇（Ethanol）或丙酮-乙醇混合液

複染劑：沙黃（Safranin）或稀釋石炭酸品紅（Carbol Fuchsin）

第一步：塗片
、固定

1
、製備塗片：取一滴無菌水或生理鹽水於載玻片中央
，用無菌接種環挑取少量菌落，均勻塗布成直徑約1厘米的薄層膜。

2、風幹：在空氣中自然風幹。

3
、熱固定：將塗有菌膜的一麵朝上
，快速通過酒精燈火焰2-3次。此步驟旨在殺死細菌並使其牢固附著在玻片上，但需避免過度加熱導致細胞形態改變。

第二步：結晶紫初染

1、用結晶紫染液覆蓋菌膜
，染色1分鍾。

2、用緩流自來水輕輕衝洗，洗去多餘染液，甩幹玻片上多餘水分。

第三步：碘液媒染

1
、用路哥氏碘液覆蓋菌膜，染色1分鍾。

2
、碘液作為媒染劑
，能與結晶紫形成分子量更大

、溶解度更低的結晶紫-碘複合物（CV-I Complex）。

3、再次用緩流自來水輕輕衝洗，甩幹。

第四步：乙醇脫色（最關鍵的一步）

1
、將載玻片傾斜，用95%乙醇滴流衝洗塗片
，直至流下的乙醇幾乎無色（此過程通常僅需5-15秒，具體時間需經驗判斷）。

2
、立即用緩流水輕輕衝洗
，終止脫色。

第五步：沙黃複染

1、用沙黃染液覆蓋菌膜，複染30秒至1分鍾。

2、用緩流自來水衝洗幹淨，用吸水紙輕輕吸幹或自然風幹。

鏡檢：待玻片完全幹燥後，在油鏡下（100×物鏡）觀察。紫色為革蘭氏陽性菌（G⁺），紅色為革蘭氏陰性菌（G⁻）。

Q1：脫色環節如何把握？時間太短或太長會怎樣？

問題：脫色是革蘭氏染色中最需要經驗的一步


，難以精確計時。

影響：

脫色不足：如果乙醇作用時間太短，所有細菌（包括G⁻菌）的CV-I複合物都未被充分洗脫
，在複染後G⁻菌也可能呈現紫色，導致假陽性結果。

脫色過度：如果乙醇作用時間太長，G⁺菌細胞壁中的CV-I複合物也會被部分或全部洗脫
，隨後被染成紅色，導致假陰性結果。

解決方案：采用滴流法而非浸泡法
，並密切觀察流出液的顏色
，當其從深紫色變為淡紫色或無色時立即停止。新手可用已知的G⁺（如金黃色葡萄球菌）和G⁻（如大腸杆菌）菌株做對照練習。

Q2：為什麼會出現“革蘭氏可變性”或結果不明確？

菌齡問題：使用老齡細菌（培養超過24-48小時）時

，G⁺菌的細胞壁可能受損，肽聚糖降解，導致脫色時染料泄漏而呈紅色或紫色不均勻（革蘭氏可變性）。

塗片過厚：菌膜過厚會使脫色劑無法均勻作用，內部細菌脫色不充分
，可能導致G⁻菌核心呈紫色，外圍呈紅色。

解決方案：始終使用18-24小時內的新鮮培養物製備薄而均勻的塗片。

Q3：染色結果中背景有沉澱或雜質怎麼辦？

問題：視野中有大量顆粒狀沉澱
，影響觀察。

原因：通常是染液沉澱或塗片清洗不徹底所致。

解決方案：確保所有染液經過過濾且無沉澱
；每一步衝洗後應充分甩幹玻片上的積水，再進行下一步操作。

Q4：熱固定時需要注意什麼？

問題：固定不牢或細胞變形。

影響：固定不牢會導致菌體在染色衝洗過程中被衝走；過度加熱會使細胞扭曲、破裂，影響形態觀察和染色結果。

解決方案：將玻片在火焰上以不燙手背的溫度快速通過2-3次即可。

Q5：鏡檢時視野中找不到細菌或細菌數量很少？

原因：可能因塗片時菌量取得太少，或衝洗步驟水流過猛將菌膜衝掉。

解決方案：挑取適量菌苔，確保塗片有足夠的細菌密度；所有衝洗步驟必須使用緩流的水，並讓水從玻片一端流下，避免直接衝刷菌膜區域。