在水溶液中，pH值被校準以提供正確的pH值——你需要確認的緩衝液是水溶液。如果你用添加了有機相的水溶液來測量pH值，pH值就會與有機相添加前的pH值不同。

然而
，最重要的一點是要保持一致。如果你總是在添加有機相後測量pH值，確保你在方法中說明了這一點，以便每個人都用同樣的方法。它不會百分百準確，但至少會是一致的。這可能比精確的pH值更重要。

緩衝液是用來控製pH值和抵抗pH值變化的。方法的許多其他部分(例如樣品基質、空氣中的二氧化碳、流動相中水的來源)可以改變流動相的pH值，從而導致保留、峰形和峰值響應的變化。甲酸，三氟乙酸等不屬於緩衝試劑。

每個緩衝鹽有2個pH值單位範圍
，它提供了最佳的pH穩定性。在緩衝範圍外麵，鹽對pH值的變化是無效的。要麼在正確的範圍內使用緩衝區，要麼選擇一個範圍覆蓋所需pH值的緩衝區。

將水的緩衝液混合到有機相中，會導致緩衝液沉澱的高風險——在許多情況下，變化微小，以至於可能不太明顯。常常是將有機物質添加到水相，這大大降低了緩衝沉澱的風險。

現代泵在混合流動相和在線脫氣上非常有效
，然而，並不是每個使用你的方法的人都有一個高質量的泵。預混合你的A和B，混合成一個單一的溶液
，在A管路上100%運行。

將950mL的水溶液與50mL的有機溶液混合，然後過濾和脫氣。這降低了HPLC之間的可變性，降低了係統中氣泡和沉降的風險。

注意，在泵上混合的95:5不會和在瓶中預拌的95:5相同的保留時間——你通常需要在預混合時添加更多的有機成分。

隻使用你正在使用的緩衝鹽的酸或堿。舉例來說，磷酸鈉緩衝液應該僅用磷酸或氫氧化鈉來調節。

例如，將5g的磷酸鈉放入1000ml的水中

緩衝劑的類型(單鹽基
，二鹽基，三鹽基)決定了它的pH緩衝範圍。

所需的質量濃度決定了緩衝強度。5g無水磷酸氫鈉和5g一水合磷酸氫鈉會有不同的緩衝強度
，並會影響到保留。

如果前一種方法在B管路中使用了緩衝液，而你的方法在B管路中使用了有機相，那麼緩衝液很有可能會在你的泵管路/泵頭中沉澱。我在早期就這樣做了
，並且造成了很大的傷害。如果有懷疑——把它衝出來(用80:20水:有機相)。

如果沒有足夠的流動相來完成運行——將有50%的可能性，氣體將會在最後幾個樣品的中運行。除了磨損你的泵和色譜柱走幹的風險，流動相從表麵蒸發
，所以在瓶子頂部的流動相與大多數體積相比成分將會改變。如果你使用瓶子裏的最後少量的流動相，頂部的這個部分恰好是貫穿柱子的東西。

這對確保你所有的緩衝鹽溶解都很好，但這是最不有效的脫氣方法，它會迅速加熱流動相，導致有機部分蒸發。節省你日後的問題——用5分鍾的時間來過濾你的流動相——它會在一個步驟中脫氣和過濾。