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UPLC：超高效液相色譜（Ultra Performance Liquid Chromatography）
色譜理論認為提高色譜柱的效能（efficiency）就能增加儀器的解析度（resolution），而運用粒徑低於2μm的(de)小(xiao)顆(ke)粒(li)無(wu)疑(yi)是(shi)增(zeng)加(jia)效(xiao)能(neng)的(de)好(hao)方(fang)法(fa)。但(dan)減(jian)小(xiao)固(gu)定(ding)相(xiang)的(de)粒(li)度(du)以(yi)增(zeng)加(jia)色(se)譜(pu)柱(zhu)效(xiao)能(neng)一(yi)直(zhi)的(de)色(se)譜(pu)儀(yi)器(qi)科(ke)學(xue)的(de)瓶(ping)頸(jing)，因(yin)為(wei)小(xiao)顆(ke)粒(li)不(bu)僅(jin)要(yao)求(qiu)係(xi)統(tong)能(neng)承(cheng)受(shou)高(gao)於(yu)目(mu)前(qian)極(ji)限(xian)壓(ya)力(li)（比如9000psi），需要更小的係統體積（死體積），並且需要能適應可能隻有幾秒峰寬的高速檢測器。
UHPLC：超高效液相色譜 (Ultra-High Performance Liquid Chromatography)
特點是工作壓力超過6000 psi或工作溫度超過環境溫度的應用。由於 UHPLC 應用中使用的硬件通常可以承受 9000 psi或更高的係統壓力，因此色譜工作人員可以使用由更高級固相（其顆粒遠遠小於傳統的5 μm直徑矽膠）填充的色譜柱。采用顆粒更小的固相不僅可以實現更高的分辨率，同時還能縮短整體分析時間。
HPLC：高效液相色譜（High Performance Liquid Chromatography）
又稱“高壓液相色譜”、“高速液相色譜”等。高效液相色譜是色譜法的一個重要分支，以液體為流動相，采用高壓輸液係統，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩衝液等流動相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內各成分被分離後，進入檢測器進行檢測，從而實現對試樣的分析。該方法已成為化學、醫學、工業、農學、商檢和法檢等學科領域中重要的分離分析技術。
UPLC和HPLC的區別
與傳統的高效液相色譜(HPLC)相比，UPLC具有高分離度(ultra resolution)、高速度(ultra speed)、高靈敏度(sensitivity)等優勢。在全麵提升HPLC的速度、靈敏度和分離度諸品質的同時，保留其原有的實用性及原理。
其最顯著的優勢是可以縮短分析時間，提高工作效率。
使用UPLC確實能明顯縮短分析時間，提高效率（如某有關物質分析方法，使用HPLC運行一針是75分鍾，UPLC完全可以在10分鍾內搞定），分析效率提高將近7.5倍。
當然了，分析效率提高這麼多，其配套設備肯定也不是鬧著玩的。UPLC需要小顆粒雜化填料（1.7um）的色譜柱、更高耐壓（達15000Psi）、低係統體積的輸液單元。
學會正確維護UPLC，避免被領導罵。
溶液的製備很關鍵
在色譜係統中，溶液是一個更重要的部分，那麼UPLC中溶液的製備應該是怎樣的呢？
樣品溶液的製備
樣品的製備同樣是過濾和離心兩種方法。
過濾：根據樣品溶液的極性，選擇不同材質的0.22um濾膜過濾。
濾膜的選擇，要進行分析方法確證，濾膜的相容性實驗。
此處強調一下，必須是0.22um，千萬不要用錯。
離心：采用高速離心的方式（大於10000轉/分鍾）。
離心的方法一般適用於過濾較困難的溶液，為了保護UPLC的係統，離心完畢後建議再次進行過濾。
流動相的製備
所用有機相應是進口的色譜級別。使用的水應為超純水，MILLI-Q純水機生產的即可。
配製緩衝鹽溶液應該有效期的規定，根據各實驗室SOP規定。
所有的流動相用前必須使用0.22um的微孔濾膜過濾。
有很多同仁在平衡色譜柱時，因為使用的是甲醇/水或是乙腈/水係統，因為不涉及到緩衝鹽溶液，經常把過濾這一步省略，再次提醒大家：
UPLC係統使用的所有流動相均必須經過0.22um的微孔濾膜過濾。
色譜柱的使用
若柱效不佳，將會浪費樣品分析時間，問題排查時間，更是浪費寶貴樣品。所以色譜柱的使用操作的規範性，直接決定UPLC的分析效率與數據可靠性。
首先，應與色譜柱的供應商溝通，充分了解色譜柱的性能，如反相柱、正相柱、氰基柱、親水柱、離子交換柱等。
再次，建立色譜柱的管理SOP，在SOP中規定色譜柱的登記、啟用、使用及報廢記錄，便於色譜柱整個生命周期的管理。
色譜柱的啟用
色譜柱包裝開啟後一定要閱讀說明書，關注說明書中的注意事項，如pH的適用範圍、流動相中能否采用水、平衡時的流速，保留溶劑等。
對於正相色譜柱來說，最重點的是注意初始流速一定要小，一般0.2ml/min。
反相柱就比較麻煩一點了，先用小流速0.2ml/min的甲醇衝洗2小時，再用10%甲醇衝洗2小時，最後過渡到檢品的流動相，流速由低逐步增加到目標流速。
柱子開始使用前，必須確認係統適用性測試是否滿足要求，主要關注理論板數、分離度、拖尾因子等關鍵分離參數，驗收合格後才能使用。
色譜柱的清洗和保存
正相色譜柱進樣後一般無需刻意清洗，但是需要保存時，必須按照說明書要求選擇溶劑，以免長時間引起固定相幹涸。
反相色譜柱清洗過程：高水相等度洗脫保證緩衝鹽衝洗幹淨後，梯度洗脫的方式過渡到純有機相，等度洗脫10~30柱體積，柱溫可適當提高2~5度，方法運行完及時關閉柱溫。
對於親水作用色譜柱：最後保存盡量避免使用純有機相，應包含少量的水，比如95%的乙腈。
色譜柱的使用
使用色譜柱，應輕拿輕放，安裝零死體積。
切忌由大流速變化引起的壓力變化對色譜柱造成機械損傷，應使用逐漸提高流速的方法達到目標流速。
建立色譜柱的使用記錄，記錄中體現出理論板數、分離度拖尾因子、柱壓、保留時間、流動相體係、保存溶劑等信息，一旦發現參數異常，以便展開調查，避免偏差發生。
色譜柱使用過程中，應關注其柱壓、柱效，使用完畢後填寫“色譜使用記錄”。
色譜柱最好是專用，帶保護柱。並且使用過緩衝鹽的色譜柱最好不要用於新項目的方法開發。
低紫外區的檢測，為了避免“鬼峰”的出現，可以使用捕集柱，色譜柱使用完畢後一定要按SOP及時清洗。
對dui於yu鬼gui峰feng捕bu集ji柱zhu的de使shi用yong，很hen多duo科ke研yan單dan位wei覺jiao得de不bu可ke行xing，不bu知zhi道dao如ru何he在zai標biao準zhun中zhong進jin行xing表biao達da。其qi實shi在zai方fang法fa建jian立li過guo程cheng中zhong，如ru果guo鬼gui峰feng無wu法fa避bi免mian，可ke以yi在zai“發展報告”中說明使用鬼峰捕集柱的理由，並在標準中如實描述，以便與廠家或是QC進行方法轉移。
有關親水性色譜柱，小編也有些提議：
以HILIK色譜柱為例，使用更少或是較弱的極性溶劑可以增加極性化合物的保留。
樣(yang)品(pin)溶(rong)解(jie)的(de)溶(rong)液(ye)盡(jin)可(ke)能(neng)接(jie)近(jin)流(liu)動(dong)相(xiang)條(tiao)件(jian)的(de)初(chu)始(shi)條(tiao)件(jian)，然(ran)而(er)，極(ji)性(xing)大(da)的(de)分(fen)析(xi)物(wu)經(jing)常(chang)在(zai)有(you)機(ji)溶(rong)液(ye)中(zhong)存(cun)在(zai)溶(rong)解(jie)度(du)較(jiao)低(di)的(de)現(xian)象(xiang)，可(ke)以(yi)先(xian)用(yong)水(shui)溶(rong)解(jie)樣(yang)品(pin)，再(zai)用(yong)乙(yi)腈(jing)/水溶液進行稀釋，需要平衡溶解度和峰形之間的關係，根據化合物性質，具體情況具體分析。
色譜柱的報廢要素
1.色譜柱堵塞，壓力升高1000psi。
2.色譜柱汙染出現鬼峰、噪音增加、檢測限增大時。
3.填料塌陷或汙染引起色譜圖前沿、拖尾、分叉時。
4.理論板數、分離度、拖尾因子按各檢品質量標準規定執行，未規定的按各國藥典通則規定執行，不符合上述規定時。
UPLC使用常見問題
液相基線噪音幹擾
如果出現基線噪音較大的情況，首先應該排除檢測器的問題。
排查流動相問題時，需要重點考慮流動相的組成及檢測波長是否發生了改變？
一yi定ding要yao確que定ding您nin所suo用yong儀yi器qi上shang最zui後hou使shi用yong的de流liu動dong相xiang是shi什shen麼me？為wei了le避bi免mian這zhe個ge問wen題ti，在zai接jie上shang個ge人ren用yong儀yi器qi之zhi前qian，要yao連lian接jie兩liang通tong，用yong超chao純chun水shui將jiang儀yi器qi管guan路lu全quan部bu清qing洗xi一yi遍bian。
此ci外wai還hai需xu要yao考kao慮lv流liu動dong相xiang的de互hu溶rong性xing的de問wen題ti。不bu相xiang混hun溶rong的de溶rong劑ji不bu能neng用yong作zuo梯ti度du洗xi脫tuo的de流liu動dong相xiang。有you些xie溶rong劑ji在zai一yi定ding比bi例li內nei混hun溶rong，超chao出chu範fan圍wei後hou就jiu不bu互hu溶rong，使shi用yong時shi更geng要yao引yin起qi注zhu意yi。當dang有you機ji溶rong劑ji和he緩huan衝chong液ye混hun合he時shi，還hai可ke能neng析xi出chu鹽yan的de晶jing體ti，尤you其qi使shi用yong磷lin酸suan鹽yan時shi需xu特te別bie小xiao心xin。
梯度洗脫所用的溶劑純度要求更高，為了保證良好的重現性。進行樣品分析前必須進行空白梯度洗脫，以辯證溶劑雜質峰。
分析弱酸性樣品時，通常在流動相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸鹽緩衝液和1%醋酸溶液；分析弱堿樣品時，通常在流動相中加入少量弱堿，常用50mmol/L磷酸鹽緩衝液和30mmol/L三乙胺溶液。
流動相中加入有機胺可以減弱弱堿性樣品和殘餘矽醇基的強相互作用，減輕或消除峰拖尾現象。所以在此使用的有機胺也成為減尾劑。
要yao確que保bao所suo使shi用yong流liu動dong相xiang不bu改gai變bian填tian料liao的de任ren何he性xing質zhi。低di交jiao聯lian度du的de離li子zi交jiao換huan樹shu脂zhi和he排pai阻zu色se譜pu填tian料liao有you時shi遇yu到dao某mou些xie有you機ji相xiang會hui溶rong脹zhang或huo收shou縮suo，從cong而er改gai變bian色se譜pu柱zhu填tian床chuang的de性xing質zhi。堿jian性xing流liu動dong相xiang不bu能neng用yong於yu矽gui膠jiao柱zhu係xi統tong。酸suan性xing流liu動dong相xiang不bu能neng用yong於yu氧yang化hua鋁lv、氧化鎂等吸附劑的柱係統。
即使經過0.22um濾膜過濾，在保質期時間內，有的流動相仍會存在長菌、沉澱、結晶等現象。
流動相不幹淨，進入液相係統是非常危險的，尤其是緩衝鹽。
在此有一個小竅門：用激光筆測試，不幹淨的緩衝鹽溶液在激光筆照射時，裏麵會看到一條紅線。
最後，還有濾膜的相容性問題，有的濾膜可以引起基線及噪音的波動，遇到這種情況，需要進行濾膜篩選。
液相壓力波動
最常見原因是泵內有氣泡。
其他還有：
溶劑進口過濾芯堵塞（最好更換新的過濾芯，一旦長菌，是不可逆的）、未充分混勻（尤其是有機相和水相相差比例懸殊時）、溶劑未脫氣、泵的密封墊老化、出口單向閥實效、主動閥失效等。
液相壓力過低包含原因
首先想到的是連接管路泄露或其他設備不密封，如泵頭密封墊。
還會存在溶劑進口過濾芯堵塞，溶劑無法通過、溶劑或流速改變、主/被動閥失靈、四元比例閥失靈、單向出口閥失靈、色譜柱固定相流失等原因。
液相壓力過高包含原因
這個原因各位同仁應該都很熟悉，如：色譜柱汙染、柱子進口過濾芯被汙染、PURGE閥過濾芯汙染、連接管路堵塞、進樣器旋轉密封閥被堵塞或進樣針或針座被堵塞等。
係統優化時所需過度溶劑
1.反相和正相相互轉換：
所用溶劑為異丙醇，原因：排除係統中空氣的最好溶劑。
2.使用緩衝液後衝洗係統：
所用溶劑為二次蒸餾水，原因：再溶解緩衝液結晶的最好溶劑。
3.更換溶劑後：
所用溶劑為二次蒸餾水，原因：再溶解緩衝液結晶的最好溶劑。
