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色譜填料的選擇
一、矽膠基質填料
矽膠是HPLC填(tian)料(liao)最(zui)普(pu)遍(bian)的(de)基(ji)質(zhi)。除(chu)了(le)具(ju)有(you)無(wu)機(ji)物(wu)基(ji)質(zhi)共(gong)有(you)的(de)高(gao)強(qiang)度(du)，還(hai)提(ti)供(gong)了(le)一(yi)個(ge)表(biao)麵(mian)，可(ke)以(yi)通(tong)過(guo)成(cheng)熟(shu)的(de)矽(gui)烷(wan)化(hua)技(ji)術(shu)鍵(jian)合(he)範(fan)圍(wei)很(hen)廣(guang)的(de)配(pei)基(ji)，製(zhi)成(cheng)反(fan)相(xiang)、離子交換、疏水作用、親(qin)水(shui)作(zuo)用(yong)或(huo)分(fen)子(zi)排(pai)阻(zu)色(se)譜(pu)。矽(gui)膠(jiao)基(ji)質(zhi)填(tian)料(liao)適(shi)用(yong)廣(guang)泛(fan)的(de)溶(rong)劑(ji)，從(cong)極(ji)性(xing)到(dao)非(fei)極(ji)性(xing)。其(qi)缺(que)點(dian)是(shi)在(zai)水(shui)溶(rong)性(xing)堿(jian)性(xing)流(liu)動(dong)相(xiang)中(zhong)不(bu)穩(wen)定(ding)。通(tong)常(chang)，矽(gui)膠(jiao)基(ji)質(zhi)的(de)填(tian)料(liao)推(tui)薦(jian)的(de)常(chang)規(gui)分(fen)析(xi)pH範圍為2～8。
1、正相色譜
正相色譜用的固定相通常為矽膠(Silica)以及其它具有極性官能團,如胺基團(NH2,APS)和氰基團(CN,CPS)的鍵合相填料。由於矽膠表麵的矽羥基(SiOH)huoqitajixingjituanjixingjiaoqiang，yinci，fenlidecixushiyijuyangpinzhonggezufendejixingdaxiao，jijixingjiaoruodezufenzuixianbeichongxichusepuzhu。zhengxiangsepushiyongdeliudongxiangjixingxiangduibigudingxiangdi，ru：正己烷(Hexane)、氯仿(Chloroform)、二氯甲烷(Methylene Chloride)等。
2、反相色譜
反相色譜用的填料常是以矽膠為基質，表麵鍵合有極性相對較弱的官能團的鍵合相。反相色譜所使用的流動相極性較強，通常為水、緩衝液與甲醇、乙腈等的混合物。樣品流出色譜柱的順序是極性較強的組份最先被衝洗出，而極性弱的組份會在色譜柱上有更強的保留。
常用的反相填料有：C18(ODS)、C8(MOS)、C4(Butyl)、C6H5(Phenyl)等。
二、聚合物填料
聚合物填料多為聚苯乙烯-二乙烯基苯或聚甲基丙烯酸脂等，其優點是在pH值為1～14均可使用。相對於矽膠基質的C18填(tian)料(liao)，這(zhe)類(lei)填(tian)料(liao)具(ju)有(you)較(jiao)強(qiang)的(de)疏(shu)水(shui)性(xing)，而(er)且(qie)大(da)孔(kong)的(de)聚(ju)合(he)物(wu)對(dui)蛋(dan)白(bai)質(zhi)等(deng)樣(yang)品(pin)的(de)分(fen)離(li)非(fei)常(chang)有(you)效(xiao)。其(qi)缺(que)點(dian)是(shi)相(xiang)對(dui)矽(gui)膠(jiao)基(ji)質(zhi)填(tian)料(liao)，色(se)譜(pu)柱(zhu)柱(zhu)效(xiao)較(jiao)低(di)。
三、其它無機填料
其它HPLCdewujitianliaosepuzhuyeyijingshangpinhuayouyuqiteshudexingzhi，yibanjinxianyuteshudeyongtu。ru，shimohuatanheizhengzhujianchengweifanxiangsepuzhutianliao。zhezhongtianliaodefenlibutongyuguijiaojizhiwanjijianhexiang，shimohuatandebiaomianjishibaoliudejichu，buzaixuqitadebiaomiangaixing。gaizhutianliaoyibanbiwanjijianhexiangguijiaohuoduokongjuhewutianliaodebaoliunengligengqiang。shimohuatankeyongyufenlimouxiejiheyigouti，youyuzaiHPLC流動相中不會被溶解，這類柱可在任何PH與溫度下使用。氧化鋁也可以用於HPLC。氧化鋁微粒剛性強，可製成穩定的色譜柱柱床，其優點是可以在pH高達12的(de)流(liu)動(dong)相(xiang)中(zhong)使(shi)用(yong)。但(dan)由(you)於(yu)氧(yang)化(hua)鋁(lv)與(yu)堿(jian)性(xing)化(hua)合(he)物(wu)的(de)作(zuo)用(yong)也(ye)很(hen)強(qiang)，應(ying)用(yong)範(fan)圍(wei)受(shou)到(dao)一(yi)定(ding)限(xian)製(zhi)，所(suo)以(yi)未(wei)能(neng)廣(guang)泛(fan)應(ying)用(yong)。新(xin)型(xing)色(se)譜(pu)氧(yang)化(hua)鋯(gao)基(ji)質(zhi)填(tian)料(liao)也(ye)可(ke)用(yong)於(yu)HPLC。商品化的隻有聚合物塗層的多孔氧化鋯微球色譜柱，應用pH1～14，溫度可達100℃。由於氧化鋯填料是最近幾年才開始研究，加之麵臨的實驗難度，其重要用途與優勢尚在進行之中。
填料粒度的選擇
目前，高效液相色譜柱廠家色譜填料粒度從1 um到超過30 um均有銷售，而目前分析分離主要用3和5 um填料進行。填料的粒度主要影響 填充柱的兩個參數，即柱效和背壓。粒度越小，柱壓越大，柱壓的增加限製了粒度小於3 um的填料應用。在相同選擇性條件下，提高柱效可提高分離度，但不是唯 一的因素。如果固定相選擇是正確，但是分離度不夠，那麼選用更小的粒度的填料是很有用的。3um填料填充柱的柱效比相同條件下的5um填料的柱效提高近 30%；然而，3um的色譜柱的背壓卻是5um的2倍。與此同時，柱效提高意味著在相同條件下可以選用更短的色譜柱，即相同的塔板數或分離能力，但是柱長 更geng短duan，以yi縮suo短duan分fen析xi時shi間jian。另ling外wai，可ke以yi采cai用yong低di粘zhan度du的de溶rong劑ji做zuo流liu動dong相xiang或huo增zeng加jia色se譜pu柱zhu的de使shi用yong溫wen度du，比bi如ru用yong乙yi腈jing代dai替ti甲jia醇chun，以yi降jiang低di色se譜pu柱zhu的de壓ya力li。
液相色譜柱的使用
色(se)譜(pu)柱(zhu)在(zai)使(shi)用(yong)前(qian)，最(zui)好(hao)進(jin)行(xing)柱(zhu)的(de)性(xing)能(neng)測(ce)試(shi)，並(bing)將(jiang)結(jie)果(guo)保(bao)存(cun)起(qi)來(lai)，作(zuo)為(wei)今(jin)後(hou)評(ping)價(jia)柱(zhu)性(xing)能(neng)變(bian)化(hua)的(de)參(can)考(kao)。在(zai)做(zuo)柱(zhu)性(xing)能(neng)測(ce)試(shi)時(shi)要(yao)按(an)照(zhao)色(se)譜(pu)柱(zhu)出(chu)廠(chang)報(bao)告(gao)中(zhong)的(de)條(tiao)件(jian)進(jin)行(xing)(出廠測試所使用的條件是最佳條件)，隻有這樣，測得的結果才有可比性。但要注意：柱性能可能由於所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同。
1、樣品的前處理
最好使用流動相溶解樣品。
使用預處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產生不可逆吸附的雜質。
使用0.45μm的過濾膜過濾除去微粒雜質。
2、流動相的配製
液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質量交換而達到分離的目的，因此要求流動相具備以下的特點：
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流動相對樣品具有一定的溶解能力，保證樣品組分不會沉澱在柱中(或長期留在柱中)。
流動相與樣品不產生化學反應。
流動相的黏度要盡量小，以便得到好的分離效果；降低柱壓降，延長泵的使用壽命(可運用提高溫度的方法降低流動相的黏度)。
流動相的物化性質要與使用的檢測器相適應。如使用UV檢測器，最好使用對紫外吸收較低的溶劑配製。
流動相沸點不要太低，否則容易產生氣泡，導致實驗無法進行。
在流動相配製好後，一定要進行脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利於檢測，還可以防止流動相中的微量氧與樣品發生作用
