液相色譜的柱子通常分為正相柱和反相柱。正相柱大多以矽膠為柱，或是在矽膠表麵鍵合-CN,-NH3等官能團的鍵合相矽膠柱；反相柱填料主要以矽膠為基質，在其表麵鍵合非極性的十八烷基官能團(ODS)稱為C18柱
，其它常用的反相柱還有C8,C4,C2和苯基柱等。另外還有離子交換柱，GPC柱，聚合物填料柱等。本文重點介紹反相色譜柱的選擇和使用：

 

 一、反相色譜柱的選擇

 1．柱子的pH值使用範圍　　

反相柱優點是固定相穩定，應用廣泛，可使用多種溶劑。但矽膠為基質的填料，使用時一定要注意流動相的PH範圍。一般的C18柱pH值範圍都在2-8，流動相的pH值小於2時，會導致鍵合相的水解；當pH值大於7時矽膠易溶解
；經常使用緩衝液固定相要降解。一旦發生上述情況，色譜柱人口處會塌陷。同樣填料各種不同牌號的色譜柱不盡相同。如果流動相PH較高或經常使用緩衝液時，建議選擇pH範圍大的柱子。

2．填料的端基封尾(或稱封口)　　

把填料的殘餘矽羥基采用封口技術進行端基封尾
，可改善對極性化合物的吸附或拖尾；含碳量增高了

，有利於不易保留化合物的分離
；填料穩定性好了，組分的保留時間重現性就好。如果待分析的樣品屬酸性或堿性的化合物，最好選用填料經端基封尾的色譜柱。

 

二、液相色譜柱的使用　　

色(se)譜(pu)柱(zhu)在(zai)使(shi)用(yong)前(qian)，最(zui)好(hao)進(jin)行(xing)柱(zhu)的(de)性(xing)能(neng)測(ce)試(shi)
，並(bing)將(jiang)結(jie)果(guo)保(bao)存(cun)起(qi)來(lai)
，作(zuo)為(wei)今(jin)後(hou)評(ping)價(jia)柱(zhu)性(xing)能(neng)變(bian)化(hua)的(de)參(can)考(kao)。在(zai)做(zuo)柱(zhu)性(xing)能(neng)測(ce)試(shi)時(shi)要(yao)按(an)照(zhao)色(se)譜(pu)柱(zhu)出(chu)廠(chang)報(bao)告(gao)中(zhong)的(de)條(tiao)件(jian)進(jin)行(xing)(出廠測試所使用的條件是最佳條件)，隻有這樣
，測得的結果才有可比性。但要注意：柱性能可能由於所使用的樣品、流動相、柱溫等條件的差異而有所不同。

1、樣品的前處理　　a
、最好使用流動相溶解樣品。　　b、使用預處理柱除去樣品中的強極性或與柱填料產生不 可逆吸附的雜質。　　c、使用0.45—0.8μm的過濾膜過濾除去微粒雜質。

2、流動相的配製　　

液相色譜是樣品組分在柱填料與流動相之間質量交換而達到分離的目的，因此要求流動相具備以下的特點：　　a
、流動相對樣品具有一定的溶解能力
，保證樣品組分不會沉澱在柱中(或長時間保留在柱中)。　　b、流動相與樣品不產生化學反應　　c、流動相的黏度要盡量小，以便得到好的分離效果；降低柱壓降


，延長泵的使用壽命(可運用提高溫度的方法降低流動相的黏度)。　　d、流動相的物化性質要與使用的檢測器相適應。如使用UV檢測器，最好使用對紫外吸收較低的溶劑配製。　　e、流動相沸點不要太低，否則容易產生氣泡，導致實驗無法進行。    　　f、在流動相配製好後，一定要進行脫氣。除去溶解在流動相中的微量氣體既有利於檢測，還可以防止流動相中的微量氧與樣品發生作用。　　

3、流動相流速的選擇　　

yinzhuxiaoshizhuzhongliudongxiangxianxingliusudehanshu，shiyongbutongdeliusukededaobutongdezhuxiao。duiyuyigentedingdesepuzhu，yaozhuiqiuzuijiazhuxiao，zuihaoshiyongzuijialiusu。duineijingwei4.6mm的色譜柱
，流速一般選擇1mL／min，對於內徑為4.0mm柱
，流速0.8mL／min為佳。　　當選用最佳流速時，分析時間可能延長。可采用改變流動相的洗滌強度的方法以縮短分析時間(如使用反相柱時，可適當增加甲醇或乙腈的含量)。注意：　　a．含水流動相最好在實驗前配製
，尤其是夏天使用緩衝       溶液作為流動相不要過夜。最好加入疊氮化鈉，防止細菌生長。　　b．流動相要求使用0.45—0.8μm濾膜過濾
，除去微粒雜質。　　c．使用HPLC級溶劑配製流動相，使用合適的流動相可延長色譜柱的使用壽命
，提高柱性能。

 

三． 色譜柱的維護

1. 色譜柱的平衡　　

反相色譜柱由工廠測試後是保存在乙腈/水中的。新柱應先使用10－20倍柱體積的甲醇或乙腈衝洗色譜柱。請一定確保您分析樣品所使用的流動相和乙腈/水互溶。 每天用足夠的時間以流動相來平衡色譜柱，您就會在處理問題方麵獲得最大的"補償"，而且您的色譜柱的壽命也會變得更長！操作步驟：　　a. 平衡開始時將流速緩慢地提高
，用流動相平衡色譜柱直到獲得穩定的基線(緩衝鹽或離子對試劑流速如果較低

，則需要較長的時間來平衡)　　b. 如果使用的流動相中含有緩衝鹽，應注意用純水"過渡"即每天分析開始前必須先用純水衝洗30分鍾以上再用緩衝鹽流動相平衡； 分析結束後必須先用純水衝洗30分鍾以上除去緩衝鹽之後再用甲醇衝洗30分鍾保護柱子。

2． 色譜柱的再生　　

長期使用的色譜柱，往往柱效會下降(柱子的理論塔板數減低)。可以對色譜柱進行再生，在有條件的實驗室應使用一個廉價的泵進行柱子的再生。　　　　

建議用來衝洗柱子的溶劑體積：　

　色譜柱尺寸   柱體積   所用溶劑的體積 　　

125-4mm    　 1.6mL    　 30mL　　

250-4 mm    　 3.2mL   　 60mL　　

250-10mm   　 20mL   　   400mL 　　

選擇再生方法：　　極性固定相(如Si，NH2* 
，DIOL基色譜填料)的再生：　　正庚烷→氯仿→乙酸乙酯→丙酮→乙醇→水**　　非極性固定相(如反相色譜填料RP－18
，RP－8，CN等)的再生：　　 水→乙腈→氯仿(或異丙醇)→乙腈→水注意：　　a. 在對-NH2改性的色譜柱進行再生時，由於-NH2可能以銨根離子的形式存在，因此應該在水洗後用0.1mol/L的氨水衝洗，然後再用水衝洗至堿溶液完全流出。 　　b. 0.05mol/L稀硫酸可以用來清洗已汙染的色譜柱，如果簡單的用有機溶劑/水的處理不能夠完全洗去矽膠表麵吸附的雜質，在水洗後加用0.05mol/L稀硫酸衝洗非常有效。

3. 色譜柱的維護 　　

a．使用預柱保護分析柱(矽膠在極性流動相/離子性流動相中有一定的溶解度)　　

b．大多數反相色譜柱的pH穩定範圍是2－7.5，盡量不超過該色譜柱的pH範圍　　

c．避免流動相組成及極性的劇烈變化　　

d．流動相使用前必須經脫氣和過濾處理　　

e．如果使用極性或離子性的緩衝溶液作流動相
，應在實驗完畢柱子衝洗幹淨，並保存於甲醇或乙腈中　　

f．氯化物的溶劑對其有一定的腐蝕性
，故使用時要注意，柱及連接管內不能長時間存留此類溶劑
，以避免腐蝕。