（一）

、前期做好充足的準備工作：

根據國家標準，提前準備好要用的平板計數瓊脂
、平皿、試管、稀釋液（生理鹽水）、三角燒瓶等。

（二）、樣品接受：

收到樣品後，確認樣品包裝是否完好，並將其保存在2~8℃冰箱中，然後在能力驗證平台進行確認。

（三）、樣品處理：

按照作業指導書操作（一定要仔細閱讀作業指導書）看看是幾個樣品及實驗記錄要求。一般實驗室收到的是幹粉樣品或者是固體樣品等。假如收到的是幹粉樣品，那麼第一步就要水化。

樣品水化步驟（建議）：一般能力驗證樣品以國體粉末形式發放，以液體（CFU/mL）形式出報告。樣品水化前一定要認真、仔細閱讀作業指導書，看看用多少稀釋液水化，水化後作為原液還是多大濃度的樣品來記錄。

（四）、實驗前準備：

a、能力驗證時最好在超潔淨台或者生物安全櫃裏操作，這樣就要把超潔淨台或者生物安全櫃提前清理

、消毒處理
，確保實驗環境無菌。

b、提前把要用到的平皿
、試管、稀釋液等放到操作台上。

（五）、實驗操作：

a、稀釋

將樣品從冰箱中取出達到室溫後開啟使用
，在超潔淨台或者生物安全櫃下先用少許稀釋液（選取的生理鹽水）進行水化後吸入無菌瓶或袋中
，再用剩餘的稀釋液進行洗滌並全部轉入無菌瓶或袋中。（具體公需多少稀釋液要看作業指導書說明）

洗滌轉移時注意樣品瓶蓋的清洗和無菌操作，將全部的水化液進行均質混勻，一般作為原液立刻進行接種；再取25mL到225mL稀釋液中均質混勻，製成10-1梯度樣品勻液。

用1mL無菌吸管取1:10的樣液到9mL生理鹽水試管中，製成1:100的樣液
，以此類推。再將幾個稀釋度的樣液接種到提前做好標記的無菌平皿中。

注意事項：

a.一般能力驗證的樣品添加的菌落濃度都比較高，檢測過程一定要多做幾個稀釋度，每個稀釋度多做幾個平板平行。

b.梯度稀釋：是關鍵步驟


，必須盡可能地減少誤差（新手建議渦旋混勻，渦旋時間不宜過長，長時間離心力等作用下，微生物細胞可能死亡）。

c、傾注用培養基應在46℃水浴內保溫
，溫度過高會影響細菌生長
，過低瓊脂易於凝因而不能與菌液充分混勻。如無水浴
，應以皮膚感受較熱而不燙為宜。

d、傾注培養基的量規定不一，從12~20mL不等
，一般以15mL較為適宜
，平板過厚可影響觀察
，太薄又易於幹裂。傾注時，培基底部如有沉澱物
，應將底部棄去，以免與菌落混淆而影響計數觀察。

e
、傾注過程力度一定掌握好，絕不能把瓊脂濺出來。

f、為wei使shi菌jun落luo能neng在zai平ping板ban上shang均jun勻yun分fen布bu
，檢jian液ye加jia入ru平ping皿min時shi要yao盡jin可ke能neng放fang在zai中zhong央yang部bu位wei，然ran後hou應ying盡jin快kuai傾qing注zhu培pei養yang基ji並bing旋xuan轉zhuan混hun勻yun，可ke正zheng反fan兩liang個ge方fang向xiang旋xuan轉zhuan，檢jian樣yang從cong開kai始shi稀xi釋shi到dao傾qing注zhu最zui後hou一yi個ge平ping皿min所suo用yong時shi間jian不bu宜yi超chao過guo20min
，以防止細菌有所死亡或繁殖。

g
、瓊脂瓶放水浴鍋前一定要混合均勻，以防出現平皿不凝固現象；拿出傾注時要用噴有75%酒精的抹布擦拭幹淨。

h、冷卻的過程不要著急，冷卻充分後再倒置放進培養箱培養，放置的時候要盡量避免放到風機口處，每摞不要超過6個平皿。

i
、檢驗結束後所有的稀釋液樣品一定要放到冰箱裏0-5℃冷藏
，以備必須再用（一旦第二天發現實驗做錯了，在做一次實驗，死馬當活馬醫）。