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開(kai)發(fa)方(fang)法(fa)或(huo)方(fang)法(fa)驗(yan)證(zheng)時(shi)最(zui)重(zhong)要(yao)的(de)一(yi)步(bu)就(jiu)是(shi)流(liu)動(dong)相(xiang)的(de)選(xuan)擇(ze)和(he)比(bi)例(li)的(de)調(tiao)整(zheng)。我(wo)想(xiang)大(da)家(jia)肯(ken)定(ding)都(dou)遇(yu)到(dao)過(guo)分(fen)離(li)度(du)不(bu)好(hao)或(huo)峰(feng)形(xing)不(bu)好(hao)的(de)情(qing)況(kuang)，大(da)部(bu)分(fen)原(yuan)因(yin)就是流動相沒調好，那到底該怎麼調，怎麼選擇呢？看完下文可能你就知道答案了。
01 由強到弱
一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或緩衝溶液)進行試驗，這樣可以很快地得到分離結果，然後根據出峰情況調整有機溶劑(乙腈或甲醇)的比例。
02三倍規則
每減少10%的有機溶劑(甲醇或乙腈)的量，保留因子約增加3倍，此為三倍規則。這是一個聰明而又省力的辦法。調整的過程中，注意觀察各個峰的分離情況。
03 粗調轉微調
當分離達到一定程度，應將有機溶劑10%的改變量調整為5%，並據此規則逐漸降低調整率，直至各組分的分離情況不再改變。
1、流動相的性質要求一個理想的液相色譜流動相溶劑應具有低粘度、與檢測器兼容性好、易於得到純品和低毒性等特征。選擇流動相時應考慮以下幾個方麵：
①liudongxiangyingbugaibiantianliaoderenhexingzhi。dijiaoliandudelizijiaohuanshuzhihepaizuseputianliaoyoushiyudaomouxieyoujixianghuirongzhanghuoshousuo，congergaibiansepuzhutianchuangdexingzhi。jianxingliudongxiangbunengyongyuguijiaozhuxitong。suanxingliudongxiangbunengyongyuyanghualv、氧化鎂等吸附劑的柱係統。
②純度。色譜柱的壽命與大量流動相通過有關，特別是當溶劑所含雜質在柱上積累時。
③必須與檢測器匹配。使用UVjianceqishi，suoyongliudongxiangzaijiancebochangxiayingmeiyouxishou，huoxishouhenxiao。dangshiyongshichazheguangjianceqishi，yingxuanzezheguangxishuyuyangpinchabiejiaodaderongjizuoliudongxiang，yitigaolingmindu。
④粘度要低（應<2cp）。高粘度溶劑會影響溶質的擴散、傳質，降低柱效，還會使柱壓降增加，使分離時間延長。最好選擇沸點在100℃以下的流動相。
⑤對樣品的溶解度要適宜。如果溶解度欠佳，樣品會在柱頭沉澱，不但影響了純化分離，且會使柱子惡化。
⑥樣品易於回收。應選用揮發性溶劑。
2．流動相的pH值采用反相色譜法分離弱酸（3≤pKa≤7）或弱堿（7≤pKa≤8）樣品時，通過調節流動相的pH值，以抑製樣品組分的解離，增加組分在固定相上的保留，並改善峰形的技術稱為反相離子抑製技術。對於弱酸，流動相的pH值越小，組分的k值越大，當pH值遠遠小於弱酸的pKa值時，弱酸主要以分子形式存在；對弱堿，情況相反。分析弱酸樣品時，通常在流動相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸鹽緩衝液和1%醋酸溶液；分析弱堿樣品時，通常在流動相中加入少量弱堿，常用50mmol/L磷酸鹽緩衝液和30mmol/L三乙胺溶液。注：流動相中加入有機胺可以減弱堿性溶質與殘餘矽醇基的強相互作用，減輕或消除峰拖尾現象。所以在這種情況下有機胺（如三乙胺）又稱為減尾劑或除尾劑。
三乙胺triethylamine 氨分子中的氫原子被3個乙基取代的產物。分子式(CH3CH2)3N。易揮發的無色液體，有氨的氣味。熔點－114.7℃，沸點89.3℃，相對密度0.7275（20／4℃）。溶於水和乙醇、乙醚等有機溶劑。三乙胺有堿性，與無機酸能生成易溶於水的鹽類。可由N，N- 二乙基乙酰氨與氫化鋁鋰反應製取，也可用乙醇胺進行氣相烷基化反應合成。用於製橡膠硫化促進劑、潤濕劑和殺菌劑等，也可用作溶劑和用於合成四級銨化合物。
3. 如何選擇緩衝液PH值在選擇緩衝液PH值之前，應先了解被分析物的Pka，高於或低於Pka兩個PH值單位的，有助於獲得好的、尖銳的峰，從HH公式：PH＝Pka＋log（[A-]/[A]）得知，溶液PH值高於或低於Pka兩個單位，化合物中99％以一種形式存在，而一種形式存在的化合物才能獲得好的尖銳的峰。顯示的是它的離子形式和中性化合物的轉變，苯甲酸的Pka等於4.2，理論上由HH公示得知，當溶液PH值等於2.2時，99％的苯甲酸以中性化合物存在，PH值等於6.2時99%的苯甲酸以離子形式存在，所以當緩衝液PH值等於2.2時，中性化合物以羧酸形式保留於反相柱。
4．流動相的脫氣HPLC所用流動相必須預先脫氣，否則容易在係統內逸出氣泡，影響泵的工作。氣泡還會影響柱的分離效率，影響檢測器的靈敏度、基線穩定性，甚至使無法檢測。（噪聲增大，基線不穩，突然跳動）。
此外，溶解在流動相中的氧還可能與樣品、流動相甚至固定相（如烷基胺）反應。溶解氣體還會引起溶劑pH的變化，對分離或分析結果帶來誤差。溶解氧能與某些溶劑（如甲醇、四氫呋喃）形成有紫外吸收的絡合物，此絡合物會提高背景吸收（特別是在260nm以下），並導致檢測靈敏度的輕微降低，但更重要的是，會在梯度淋洗時造成基線漂移或形成鬼峰（假峰）。在熒光檢測中，溶解氧在一定條件下還會引起淬滅現象，特別是對芳香烴、脂肪醛、酮等。在某些情況下，熒光響應可降低達95%。在電化學檢測中（特別是還原電化學法），氧的影響更大。
除去流動相中的溶解氧將大大提高UV檢測器的性能，也將改善在一些熒光檢測應用中的靈敏度。常用的脫氣方法有：加熱煮沸、抽真空、超聲、吹氦等。對混合溶劑，若采用抽氣或煮沸法，則需要考慮低沸點溶劑揮發造成的組成變化。超聲脫氣比較好，10~20分鍾的超聲處理對許多有機溶劑或有機溶劑/水混合液的脫氣是足夠了（一般500ml溶液需超聲20~30min方可），此法不影響溶劑組成。超聲時應注意避免溶劑瓶與超聲槽底部或壁接觸，以免玻璃瓶破裂，容器內液麵不要高出水麵太多。離線（係統外）脫氣法不能維持溶劑的脫氣狀態，在你停止脫氣後，氣體立即開始回到溶劑中。在1~4小時內，溶劑又將被環境氣體所飽和。
在線（係統內）脫(tuo)氣(qi)法(fa)無(wu)此(ci)缺(que)點(dian)。最(zui)常(chang)用(yong)的(de)在(zai)線(xian)脫(tuo)氣(qi)法(fa)為(wei)鼓(gu)泡(pao)，即(ji)在(zai)色(se)譜(pu)操(cao)作(zuo)前(qian)和(he)進(jin)行(xing)時(shi)，將(jiang)惰(duo)性(xing)氣(qi)體(ti)噴(pen)入(ru)溶(rong)劑(ji)中(zhong)。嚴(yan)格(ge)來(lai)說(shuo)，此(ci)方(fang)法(fa)不(bu)能(neng)將(jiang)溶(rong)劑(ji)脫(tuo)氣(qi)，它(ta)隻(zhi)是(shi)用(yong)一(yi)種(zhong)低(di)溶(rong)解(jie)度(du)的(de)惰(duo)性(xing)氣(qi)體(ti)（通常是氦）將空氣替換出來。此外還有在線脫氣機。
一(yi)般(ban)說(shuo)來(lai)有(you)機(ji)溶(rong)劑(ji)中(zhong)的(de)氣(qi)體(ti)易(yi)脫(tuo)除(chu)，而(er)水(shui)溶(rong)液(ye)中(zhong)的(de)氣(qi)體(ti)較(jiao)頑(wan)固(gu)。在(zai)溶(rong)液(ye)中(zhong)吹(chui)氦(hai)是(shi)相(xiang)當(dang)有(you)效(xiao)的(de)脫(tuo)氣(qi)方(fang)法(fa)，這(zhe)種(zhong)連(lian)續(xu)脫(tuo)氣(qi)法(fa)在(zai)電(dian)化(hua)學(xue)檢(jian)測(ce)時(shi)經(jing)常(chang)使(shi)用(yong)。但(dan)氦(hai)氣(qi)昂(ang)貴(gui)，難(nan)於(yu)普(pu)及(ji)。
5．流動相的濾過所有溶劑使用前都必須經0.45μm（或0.22μm）濾過，以除去雜質微粒，色譜純試劑也不例外（除非在標簽上標明“已濾過”）。用濾膜過濾時，特別要注意分清有機相（脂溶性）濾膜和水相（水溶性）lvmo。youjixianglvmoyibanyongyuguolvyoujirongji，guolvshuirongyeshiliusudihuolvbudong。shuixianglvmozhinengyongyuguolvshuirongye，yanjinyongyuyoujirongji，fouzelvmohuibeirongjie！溶有濾膜的溶劑不得用於HPLC。對於混合流動相，可在混合前分別濾過，如需混合後濾過，首選有機相濾膜。現在已有混合型濾膜出售。
6．流動相的貯存流動相一般貯存於玻璃、聚四氟乙烯或不鏽鋼容器內，不能貯存在塑料容器中。因許多有機溶劑如甲醇、乙酸等可浸出塑料表麵的增塑劑，導致溶劑受汙染。這種被汙染的溶劑如用於HPLC係統，可能造成柱效降低。貯存容器一定要蓋嚴，防止溶劑揮發引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶入流動相。
磷酸鹽、乙酸鹽緩衝液很易長黴，應盡量新鮮配製使用，不要貯存。如確需貯存，可在冰箱內冷藏，並在3天內使用，用前應重新濾過。容器應定期清洗，特別是盛水、緩衝液和混合溶液的瓶子，以除去底部的雜質沉澱和可能生長的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子無此現象。
7．鹵代有機溶劑應特別注意的問題鹵代溶劑可能含有微量的酸性雜質，能與HPLC係統中的不鏽鋼反應。鹵代溶劑與水的混合物比較容易分解，不能存放太久。鹵代溶劑（如CCl4、CHCl3等）與各種醚類（如乙醚、二異丙醚、四氫呋喃等）混合後，可能會反應生成一些對不鏽鋼有較大腐蝕性的產物，這種混合流動相應盡量不采用，或新鮮配製。此外，鹵代溶劑（如CH2Cl2）與一些反應性有機溶劑（如乙腈）混合靜置時，還會產生結晶。總之，鹵代溶劑最好新鮮配製使用。如果是和幹燥的飽和烷烴混合，則不會產生類似問題。
04 流動相溶劑的選擇
1.所suo選xuan用yong的de流liu動dong相xiang溶rong劑ji要yao有you一yi定ding的de化hua學xue穩wen定ding性xing，不bu與yu固gu定ding相xiang和he樣yang品pin組zu分fen起qi反fan應ying，其qi純chun度du和he化hua學xue特te性xing必bi須xu滿man足zu色se譜pu過guo程cheng的de穩wen定ding性xing和he重zhong複fu性xing的de要yao求qiu。
2.溶劑應當不幹擾檢測器的工作，溶劑應與檢測器匹配，選擇不影響檢測器正常工作應選擇在測定波長範圍內無吸收的流動相。
3.在製備分離中, 溶劑應當易於除去, 不幹擾對分離組分的回收。
4.溶劑的粘度要小，保證合適的柱壓降。
5.從實用角度考慮，溶劑應當價格低廉，容易購得，使用安全，純度要高。
05 流動相溶劑使用的注意事項
1.流動相溶劑應選擇HPLC的溶劑或依此為標準的溶劑。流動相使用前用0.45μm濾膜過濾、脫氣，清除微粒和灰塵。在送液泵內，為了防止雜物（固體）進入流路，裝有吸濾器，但網孔徑為10μm，比此更小的顆粒仍然可通過，這會導致流路和柱子堵塞和汙染。為此，建議常用0.45μm濾(lv)膜(mo)過(guo)濾(lv)。流(liu)動(dong)相(xiang)溶(rong)劑(ji)須(xu)經(jing)脫(tuo)氣(qi)，如(ru)不(bu)脫(tuo)氣(qi)，在(zai)溶(rong)劑(ji)混(hun)合(he)時(shi)，或(huo)壓(ya)力(li)溫(wen)度(du)變(bian)化(hua)時(shi)容(rong)易(yi)產(chan)生(sheng)大(da)量(liang)氣(qi)泡(pao)，會(hui)導(dao)致(zhi)泵(beng)誤(wu)動(dong)作(zuo)和(he)輸(shu)液(ye)不(bu)暢(chang)，檢(jian)測(ce)器(qi)產(chan)生(sheng)噪(zao)聲(sheng)信(xin)號(hao)等(deng)。
2.liudongxianghuifudaoshiwenhoushiyong。liudongxiangwenduyushiwenxiangchashi，liudongxiangzaihuifudaoshiwenqian，jixianshuipinghennanwending，tebieshifashengpiaoyi，yerongyichanshengqipaodengxianxiang。shuiyuyoujirongjihunheshi，hunheyebianhuada，wangwanghuiyushiwenxiangchahenda，wubizhuyi。
3.做HPLC流動相的試劑應用HPLC級的、水應用二次蒸餾水，水相流動相需經常更換，防止長菌變質。使用去離子水、針劑水、純淨水（炊用）並不合適、尤其是做梯度洗脫時，水中的不純物會成為鬼峰，從而幹擾分析結果。
4.流動相的pHzhiguogaohuoguodi，liudongxiangshiyongchunshui，shiyonggaonongdulinsuanyanhuanchongrongye，shiyongliziduishijideng，junkenengzaochengsepuzhutianliaobeihuaxuepohuai，zhezhongduisepuzhugudingxiangjijianhexiangdepohuaitongchangshibukexiufude。
5.用緩衝鹽做流動相時，在使用前和使用後都要用水清洗流路，絕對禁止將緩衝溶液留在流路中靜置過夜或更長時間。
6.若需要使用含鹽的流動相，使用前請務必過濾。並且使用該含鹽流動相前，色譜柱需先用低比例有機相（有機相含量應不低於10%）的溶液衝洗，以免緩衝鹽析出。流動相若為蒸餾水或含鹽的緩衝液，建議現用現配，以免流動相因滋生微生物而造成柱填料的汙染。
7.進jin行xing梯ti度du實shi驗yan時shi要yao注zhu意yi梯ti度du變bian化hua過guo程cheng中zhong流liu動dong相xiang的de互hu溶rong性xing，避bi免mian因yin流liu動dong相xiang不bu互hu溶rong而er導dao致zhi的de緩huan衝chong鹽yan析xi出chu問wen題ti。反fan相xiang係xi統tong更geng換huan正zheng相xiang係xi統tong或huo正zheng相xiang係xi統tong更geng換huan反fan相xiang係xi統tong時shi，用yong異yi丙bing醇chun置zhi換huan係xi統tong內nei的de儲chu存cun流liu動dong相xiang後hou在zai接jie柱zhu子zi。
8.在更換兩種互不相溶的流動相時，中間要用異丙醇溶液清洗過渡。例如：xianyongjiachunshuizuoliudongxiang，ranhouzaiyongzhengjiwanzuoliudongxiangshi，yidingyaoxianyongyibingchunrongyechongxijiachunshui，ranhouyongzhengjiwanchongxiyibingchun，fanzhiyeshiyiyang。zaigenghuanliudongxiangshihaiyaokaolvsepuzhushifougenghuan。
9.儀器在短期（兩三天）不用時，流路中可以是甲醇或水。儀器在長期不用時，流路中應用甲醇。
10.對於UV等檢測器用於高靈敏度檢測時，要使用UV吸收性小的HPLC的溶劑作為流動相溶劑，如甲醇、乙腈等。
11.當流動相溶劑為乙腈時，流速為1ml/min泵的正常壓力5～7Mpa之間，如果壓力逐漸降低，基線也出現異常。這是由於乙氰的粘性大，導致泵的流速降低。可適當提高流速使泵的壓力恢複正常即可。
12.流動相含有濃硫酸、濃硝酸、二氯乙酸、二氯甲烷、氯仿、丙酮、四氯呋南、二甲化碸等溶劑，會對流路中的PEEK樹脂管路強度變成差、PEEK樹脂管容易破裂使溶劑外濺。流動相含有鹵素離子的溶劑，如KCI、NaCI、NH4CI等。對流路中的不鏽鋼材料有腐蝕作用，以上的溶劑須盡量避免使用。非用不可時，分析完了後，應立刻用蒸餾水把全流路清洗幹淨。
13.用於檢定梯度等性能時，短時間使用在0.5%以下的低濃度丙酮水溶液是沒有問題的。
14.注意：稀硝酸與甲醇不能混合，否則有可能會引起爆炸。
06 液相色譜流動相的貯存
流動相一般貯存於玻璃、聚四氟乙烯或不鏽鋼容器內，不能貯存在塑料容器中。因許多有機溶劑如甲醇、乙酸等可浸出塑料表麵的增塑劑，導致溶劑受汙染。這種被汙染的溶劑如用於HPLC係統，可能造成柱效降低。貯存容器一定要蓋嚴，防止溶劑揮發引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶入流動相。
磷酸鹽、乙酸鹽緩衝液很易長黴，應盡量新鮮配製使用，不要貯存。如確需貯存，可在冰箱內冷藏，並在3天內使用，用前應重新濾過。容器應定期清洗，特別是盛水、緩衝液和混合溶液的瓶子，以除去底部的雜質沉澱和可能生長的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子無此現象。
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