以氣相色譜為例,氣相色譜是用峰麵積或者峰高來定量的。依據如下:
1、最重要的第一條,就是檢測器的線性響應關係。
在所有的色譜檢測器中,除了FPD之外,所有的檢測器都遵從線性響應,也就是說m=KS。這裏m指單位時間內到達檢測器的待測物質的量(包括質量或物質的量),K表示線性響應係數,S表(biao)示(shi)檢(jian)測(ce)器(qi)響(xiang)應(ying)信(xin)號(hao)的(de)值(zhi)。也(ye)就(jiu)是(shi)說(shuo),檢(jian)測(ce)器(qi)響(xiang)應(ying)信(xin)號(hao)的(de)大(da)小(xiao)與(yu)單(dan)位(wei)時(shi)間(jian)到(dao)達(da)檢(jian)測(ce)器(qi)的(de)被(bei)測(ce)物(wu)質(zhi)的(de)總(zong)量(liang)成(cheng)正(zheng)比(bi)。當(dang)然(ran)我(wo)們(men)也(ye)知(zhi)道(dao),這(zhe)個(ge)關(guan)係(xi)是(shi)有(you)範(fan)圍(wei)的(de),量(liang)太(tai)大(da)或(huo)者(zhe)太(tai)小(xiao),都(dou)會(hui)脫(tuo)離(li)線(xian)性(xing)。
2、qicijiushidiertiao,tabanlilun。tabanlilunchongfenchanshulefenggaoyujinyangliangzhijiandeguanxi,huozheshuotamenzhijianshichengzhengbide。zhegekeyicankaoduitabanlilundeshuoming。
根(gen)據(ju)這(zhe)兩(liang)條(tiao),可(ke)以(yi)肯(ken)定(ding)的(de)說(shuo)待(dai)測(ce)物(wu)質(zhi)的(de)峰(feng)高(gao)與(yu)待(dai)測(ce)物(wu)的(de)進(jin)樣(yang)總(zong)量(liang)成(cheng)正(zheng)比(bi)。或(huo)者(zhe)利(li)用(yong)微(wei)積(ji)分(fen)可(ke)以(yi)推(tui)斷(duan)出(chu)待(dai)測(ce)物(wu)質(zhi)的(de)峰(feng)麵(mian)積(ji)和(he)待(dai)測(ce)物(wu)的(de)進(jin)樣(yang)總(zong)量(liang)成(cheng)正(zheng)比(bi)。既(ji)然(ran)峰(feng)高(gao)和(he)峰(feng)麵(mian)積(ji)都(dou)與(yu)進(jin)樣(yang)總(zong)量(liang)成(cheng)正(zheng)比(bi),為(wei)什(shen)麼(me)我(wo)們(men)喜(xi)歡(huan)用(yong)峰(feng)麵(mian)積(ji),而(er)不(bu)是(shi)更(geng)簡(jian)單(dan)的(de)峰(feng)高(gao)呢(ne)?這(zhe)個(ge)問(wen)題(ti)也(ye)很(hen)簡(jian)單(dan),因(yin)為(wei)塔(ta)板(ban)理(li)論(lun)不(bu)完(wan)全(quan)正(zheng)確(que),峰(feng)形(xing)經(jing)常(chang)不(bu)完(wan)全(quan)滿(man)足(zu)正(zheng)態(tai)分(fen)布(bu),所(suo)以(yi)峰(feng)高(gao)的(de)代(dai)表(biao)性(xing)不(bu)足(zu)。什(shen)麼(me)時(shi)候(hou)峰(feng)高(gao)能(neng)夠(gou)有(you)良(liang)好(hao)的(de)代(dai)表(biao)性(xing)?很(hen)明(ming)顯(xian),峰(feng)形(xing)良(liang)好(hao)而(er)且(qie)對(dui)稱(cheng),成(cheng)良(liang)好(hao)的(de)正(zheng)態(tai)分(fen)布(bu)曲(qu)線(xian)形(xing)狀(zhuang)的(de)時(shi)候(hou),或(huo)者(zhe)說(shuo)峰(feng)形(xing)尖(jian)銳(rui)且(qie)對(dui)稱(cheng)的(de)時(shi)候(hou)。色(se)譜(pu)峰(feng)經(jing)常(chang)拖(tuo)尾(wei),所(suo)以(yi)用(yong)峰(feng)麵(mian)積(ji)定(ding)量(liang)就(jiu)可(ke)以(yi)了(le),峰(feng)麵(mian)積(ji)絕(jue)大(da)多(duo)數(shu)情(qing)形(xing)下(xia)都(dou)具(ju)有(you)很(hen)好(hao)的(de)代(dai)表(biao)性(xing)。但(dan)是(shi)在(zai)檢(jian)測(ce)器(qi)超(chao)載(zai),或(huo)模(mo)數(shu)轉(zhuan)換(huan)器(qi)超(chao)載(zai),或(huo)峰(feng)麵(mian)積(ji)積(ji)分(fen)不(bu)準(zhun),或(huo)進(jin)樣(yang)代(dai)表(biao)性(xing)不(bu)足(zu),以(yi)及(ji)一(yi)些(xie)其(qi)他(ta)特(te)殊(shu)情(qing)形(xing)下(xia),用(yong)峰(feng)麵(mian)積(ji)也(ye)不(bu)能(neng)得(de)到(dao)正(zheng)確(que)結(jie)果(guo)。但(dan)無(wu)論(lun)如(ru)何(he),用(yong)峰(feng)麵(mian)積(ji)定(ding)量(liang)已(yi)經(jing)是(shi)我(wo)們(men)可(ke)實(shi)行(xing)的(de)最(zui)準(zhun)確(que)方(fang)法(fa)了(le)。
色譜定量分析,顧名思義就是色譜分析方法來測定組分的含量,主要分為麵積百分比法、歸一化法、外標法、內(nei)標(biao)法(fa)和(he)標(biao)準(zhun)加(jia)入(ru)法(fa),色(se)譜(pu)定(ding)量(liang)分(fen)析(xi)首(shou)先(xian)需(xu)要(yao)明(ming)確(que)的(de)概(gai)念(nian)是(shi)響(xiang)應(ying)因(yin)子(zi),不(bu)同(tong)的(de)化(hua)合(he)物(wu)在(zai)檢(jian)測(ce)器(qi)的(de)響(xiang)應(ying)是(shi)不(bu)一(yi)樣(yang)的(de),簡(jian)單(dan)地(di)舉(ju)個(ge)例(li)子(zi)說(shuo),相(xiang)同(tong)濃(nong)度(du)的(de)化(hua)合(he)物(wu)A和B,相同的進樣量,得到的峰高和峰麵積不一定一樣的,響應因子的計算式如下:
式中,w為化合物的含量,A為響應值,一般為峰麵積或峰高,以峰麵積為例。
由you於yu不bu同tong的de化hua合he物wu在zai同tong一yi個ge檢jian測ce器qi的de響xiang應ying因yin子zi不bu同tong,甚shen至zhi同tong一yi個ge化hua合he物wu不bu同tong濃nong度du在zai同tong一yi檢jian測ce器qi的de響xiang應ying因yin子zi不bu同tong,簡jian單dan地di說shuo就jiu是shi化hua合he物wu在zai檢jian測ce器qi的de響xiang應ying不bu呈cheng線xian性xing,或huo者zhe線xian性xing範fan圍wei比bi較jiao窄zhai。選xuan擇ze合he適shi的de定ding量liang方fang法fa時shi,除chu需xu要yao考kao慮lv是shi相xiang對dui定ding量liang還hai是shi絕jue對dui定ding量liang外wai,同tong時shi需xu要yao考kao察cha化hua合he物wu的de線xian性xing響xiang應ying範fan圍wei、是否有合適內標、是否有標準品等。接下來就主要介紹下色譜分析中常用的三種定量方法:麵積歸一化法、外標法和內標法。
01
歸一化法
由(you)於(yu)組(zu)分(fen)的(de)量(liang)與(yu)其(qi)峰(feng)麵(mian)積(ji)成(cheng)正(zheng)比(bi),如(ru)果(guo)樣(yang)品(pin)中(zhong)所(suo)有(you)組(zu)分(fen)都(dou)能(neng)產(chan)生(sheng)信(xin)號(hao),得(de)到(dao)相(xiang)應(ying)的(de)色(se)譜(pu)峰(feng),那(na)麼(me)可(ke)以(yi)用(yong)如(ru)下(xia)歸(gui)一(yi)化(hua)公(gong)式(shi)計(ji)算(suan)各(ge)組(zu)分(fen)的(de)含(han)量(liang)。
ruoyangpinzhonggezufendexiaozhengyinzixiangjin,kejiangxiaozhengyinzixiaoqu,zhijieyongfengmianjiguiyihuajinxingjisuan。zhongguoyaodianyongbujiaxiaozhengyinzidemianjiguiyihuafacedingyaowuzhonggezazhijizazhidezongliangxiandu。
優點:簡便、準確、定量結果與進樣量重複性無關(在色譜柱不超載的範圍內)、操作條件略有變化時對結果影響較小。
缺點:必須所有組分在一個分析周期內都流出色譜柱,而且檢測器對它們都產生信號。不適於微量雜質的含量測定。
缺點:必須所有組分在一個分析周期內都流出色譜柱,而且檢測器對它們都產生信號。不適於微量雜質的含量測定。
02
外標法
yongdaicezufendechunpinzuoduizhaowuzhi,yiduizhaowuzhiheyangpinzhongdaicezufendexiangyingxinhaoxiangbijiaojinxingdingliangdefangfachengweiwaibiaofa。cifakefenweigongzuoquxianfajiwaibiaoyidianfadeng。
工作曲線法是用對照物質配製一係列濃度的對照品溶液確定工作曲線,求出斜率、截(jie)距(ju)。在(zai)完(wan)全(quan)相(xiang)同(tong)的(de)條(tiao)件(jian)下(xia),準(zhun)確(que)進(jin)樣(yang)與(yu)對(dui)照(zhao)品(pin)溶(rong)液(ye)相(xiang)同(tong)體(ti)積(ji)的(de)樣(yang)品(pin)溶(rong)液(ye),根(gen)據(ju)待(dai)測(ce)組(zu)分(fen)的(de)信(xin)號(hao),從(cong)標(biao)準(zhun)曲(qu)線(xian)上(shang)查(zha)出(chu)其(qi)濃(nong)度(du),或(huo)用(yong)回(hui)歸(gui)方(fang)程(cheng)計(ji)算(suan),工(gong)作(zuo)曲(qu)線(xian)法(fa)也(ye)可(ke)以(yi)用(yong)外(wai)標(biao)二(er)點(dian)法(fa)代(dai)替(ti)。通(tong)常(chang)截(jie)距(ju)應(ying)為(wei)零(ling),若(ruo)不(bu)等(deng)於(yu)零(ling)說(shuo)明(ming)存(cun)在(zai)係(xi)統(tong)誤(wu)差(cha)。工(gong)作(zuo)曲(qu)線(xian)的(de)截(jie)距(ju)為(wei)零(ling)時(shi),可(ke)用(yong)外(wai)標(biao)一(yi)點(dian)法(fa)(直接比較法)定量。
工作曲線法是用對照物質配製一係列濃度的對照品溶液確定工作曲線,求出斜率、截(jie)距(ju)。在(zai)完(wan)全(quan)相(xiang)同(tong)的(de)條(tiao)件(jian)下(xia),準(zhun)確(que)進(jin)樣(yang)與(yu)對(dui)照(zhao)品(pin)溶(rong)液(ye)相(xiang)同(tong)體(ti)積(ji)的(de)樣(yang)品(pin)溶(rong)液(ye),根(gen)據(ju)待(dai)測(ce)組(zu)分(fen)的(de)信(xin)號(hao),從(cong)標(biao)準(zhun)曲(qu)線(xian)上(shang)查(zha)出(chu)其(qi)濃(nong)度(du),或(huo)用(yong)回(hui)歸(gui)方(fang)程(cheng)計(ji)算(suan),工(gong)作(zuo)曲(qu)線(xian)法(fa)也(ye)可(ke)以(yi)用(yong)外(wai)標(biao)二(er)點(dian)法(fa)代(dai)替(ti)。通(tong)常(chang)截(jie)距(ju)應(ying)為(wei)零(ling),若(ruo)不(bu)等(deng)於(yu)零(ling)說(shuo)明(ming)存(cun)在(zai)係(xi)統(tong)誤(wu)差(cha)。工(gong)作(zuo)曲(qu)線(xian)的(de)截(jie)距(ju)為(wei)零(ling)時(shi),可(ke)用(yong)外(wai)標(biao)一(yi)點(dian)法(fa)(直接比較法)定量。
外標一點法是用一種濃度的對照品溶液對比測定樣品溶液中i組分的含量。將對照品溶液與樣品溶液在相同條件下多次進樣,測得峰麵積的平均值,用下式計算樣品中i組分的量:
式中Wi與Ai分別代表在樣品溶液進樣體積中所含i組分的重量及相應的峰麵積。Ws及As分別代表在對照品溶液進樣體積中含純品i組分的重量及相應峰麵積。
優點:簡便,不需用校正因子,不論樣品中其他組分是否出峰,均可對待測組分定量。
缺點:此法的準確性受進樣重複性和實驗條件穩定性的影響。
此外,為了降低外標一點法的實驗誤差,應盡量使配製的對照品溶液的濃度與樣品中組分的濃度相近。
03
內標法
選(xuan)擇(ze)樣(yang)品(pin)中(zhong)不(bu)含(han)有(you)的(de)純(chun)物(wu)質(zhi)作(zuo)為(wei)對(dui)照(zhao)物(wu)質(zhi)加(jia)入(ru)待(dai)測(ce)樣(yang)品(pin)溶(rong)液(ye)中(zhong),以(yi)待(dai)測(ce)組(zu)分(fen)和(he)對(dui)照(zhao)物(wu)質(zhi)的(de)響(xiang)應(ying)信(xin)號(hao)對(dui)比(bi),測(ce)定(ding)待(dai)測(ce)組(zu)分(fen)含(han)量(liang)的(de)方(fang)法(fa)稱(cheng)為(wei)內(nei)標(biao)法(fa)。“內標”的由來是因為標準(對照)物質加入到樣品中,有別於外標法。該對照物質稱為內標物。
在一個分析周期內不是所有組分都能流出色譜柱(如有難氣化組分),或檢測器不能對每個組分都產生信號,或隻需測定混合物中某幾個組分的含量時,可采用內標法。
在一個分析周期內不是所有組分都能流出色譜柱(如有難氣化組分),或檢測器不能對每個組分都產生信號,或隻需測定混合物中某幾個組分的含量時,可采用內標法。
準確稱量W克樣品,再準確稱量Ws克內標物,加入至樣品中,混勻,進樣。測量待測組分i的峰麵積Ai及內標物的峰麵積As,則i組分在W克樣品中所含的重量Wi,與內標物的重量Wi,有下述關係:
待測組分i在樣品中的百分含量Ci%為:
對內標物的要求:①內標物是原樣品中不含有的組分,否則會使峰重疊而無法準確測量內標物的峰麵積;②內標物的保留時間應與待測組分相近,但彼此能完全分離(R≥1.5);③內標物必須是純度合乎要求的純物質。
優點:①在進樣量不超限(色譜柱不超載)的範圍內,定量結果與進樣量的重複性無關。②隻要被測組分及內標物出峰,且分離度合乎要求,就可定量,與其他組分是否出峰無關。③很適用於測定藥物中微量有效成分或雜質的含量。由於雜質(或微量組分)與主要成分含量相差懸殊,無法用歸一化法測定含量,用內標法則很方便。
缺點:加jia一yi個ge與yu雜za質zhi量liang相xiang當dang的de內nei標biao物wu。加jia大da進jin樣yang量liang突tu出chu雜za質zhi峰feng,測ce定ding雜za質zhi峰feng與yu內nei標biao峰feng麵mian積ji之zhi比bi,即ji可ke求qiu出chu雜za質zhi含han量liang。但dan樣yang品pin配pei製zhi比bi較jiao麻ma煩fan和he內nei標biao物wu不bu易yi找zhao尋xun。
04
標準加入法
標(biao)準(zhun)加(jia)入(ru)法(fa)實(shi)質(zhi)上(shang)是(shi)一(yi)種(zhong)特(te)殊(shu)的(de)內(nei)標(biao)法(fa),是(shi)以(yi)待(dai)測(ce)組(zu)分(fen)的(de)純(chun)物(wu)質(zhi)作(zuo)為(wei)內(nei)標(biao),加(jia)入(ru)到(dao)待(dai)測(ce)樣(yang)品(pin)中(zhong),然(ran)後(hou)在(zai)相(xiang)同(tong)的(de)色(se)譜(pu)條(tiao)件(jian)下(xia),測(ce)定(ding)加(jia)入(ru)前(qian)後(hou)待(dai)測(ce)組(zu)分(fen)的(de)峰(feng)麵(mian)積(ji)(或峰高),從而計算出樣品中待測組分的含量。以峰麵積計算方法為例,標準加入法的計算如下:
式中,Δwi為加入的標準品的量,Ai為待測組分的峰麵積,ΔAi為加入標準品後待測組分峰麵積的增加量,wi為原樣品中待測組分的含量。
無論是何種定量計算方法都各有優缺點,沒有一種方法是一勞永逸,還應該根據樣品情況,具體情況具體選擇。
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