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引言
良好的分離度與定量的準確性密切相關。“昨天的分離度不太行呀，流動相要再調調！”這話是不是很熟悉？調調？！咋調？如果不知道如何配製合適的流動相請看過來！今天小編為大家整理了液相改善峰形與提升分離度相關的知識，僅供大家參考~
秘訣1：由強到弱
一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或緩衝溶液)進行試驗，這樣可以很快地得到分離結果，然後根據出峰情況調整有機溶劑(乙腈或甲醇)的比例。
秘訣2：三倍規則
每減少10%的有機溶劑(甲醇或乙腈)的量，保留因子約增加3倍，此為三倍規則。這是一個聰明而又省力的辦法。調整的過程中，注意觀察各個峰的分離情況。
秘訣3：粗調轉微調
當分離達到一定程度，應將有機溶劑10%的改變量調整為5%，並據此規則逐漸降低調整率，直至各組分的分離情況不再改變。
1．流動相的性質要求一個理想的液相色譜流動相溶劑應具有低粘度、與檢測器兼容性好、易於得到純品和低毒性等特征。
選擇流動相時應考慮以下幾個方麵：
①流(liu)動(dong)相(xiang)應(ying)不(bu)改(gai)變(bian)填(tian)料(liao)的(de)任(ren)何(he)性(xing)質(zhi)。低(di)交(jiao)聯(lian)度(du)的(de)離(li)子(zi)交(jiao)換(huan)樹(shu)脂(zhi)和(he)排(pai)阻(zu)色(se)譜(pu)填(tian)料(liao)有(you)時(shi)遇(yu)到(dao)某(mou)些(xie)有(you)機(ji)相(xiang)會(hui)溶(rong)脹(zhang)或(huo)收(shou)縮(suo)，從(cong)而(er)改(gai)變(bian)色(se)譜(pu)柱(zhu)填(tian)床(chuang)的(de)性(xing)質(zhi)。堿(jian)性(xing)流(liu)動(dong)相(xiang)不(bu)能(neng)用(yong)於(yu)矽(gui)膠(jiao)柱(zhu)係(xi)統(tong)。酸(suan)性(xing)流(liu)動(dong)相(xiang)不(bu)能(neng)用(yong)於(yu)氧(yang)化(hua)鋁(lv)、氧化鎂等吸附劑的柱係統。
②純度。色譜柱的壽命與大量流動相通過有關，特別是當溶劑所含雜質在柱上積累時。
③必須與檢測器匹配。使用UV檢jian測ce器qi時shi，所suo用yong流liu動dong相xiang在zai檢jian測ce波bo長chang下xia應ying沒mei有you吸xi收shou，或huo吸xi收shou很hen小xiao。當dang使shi用yong示shi差cha折zhe光guang檢jian測ce器qi時shi，應ying選xuan擇ze折zhe光guang係xi數shu與yu樣yang品pin差cha別bie較jiao大da的de溶rong劑ji作zuo流liu動dong相xiang，以yi提ti高gao靈ling敏min度du。
④粘度要低（應<2cp）。高粘度溶劑會影響溶質的擴散、傳質，降低柱效，還會使柱壓降增加，使分離時間延長。最好選擇沸點在100℃以下的流動相。
⑤對樣品的溶解度要適宜。如果溶解度欠佳，樣品會在柱頭沉澱，不但影響了純化分離，且會使柱子惡化。
⑥樣品易於回收。應選用揮發性溶劑。
2．流動相的pH值
采用反相色譜法分離弱酸（3≤pKa≤7）或弱堿（7≤pKa≤8）樣品時，通過調節流動相的pH值，以抑製樣品組分的解離，增加組分在固定相上的保留，並改善峰形的技術稱為反相離子抑製技術。對於弱酸，流動相的pH值越小，組分的k值越大，當pH值遠遠小於弱酸的pKa值時，弱酸主要以分子形式存在；對弱堿，情況相反。分析弱酸樣品時，通常在流動相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸鹽緩衝液和1%醋酸溶液；分析弱堿樣品時，通常在流動相中加入少量弱堿，常用50mmol/L磷酸鹽緩衝液和30mmol/L三乙胺溶液。
注：流動相中加入有機胺可以減弱堿性溶質與殘餘矽醇基的強相互作用，減輕或消除峰拖尾現象。所以在這種情況下有機胺（如三乙胺）又稱為減尾劑或除尾劑。
(三乙胺triethylamine 氨分子中的氫原子被3個乙基取代的產物。分子式(CH3CH2)3N。易揮發的無色液體，有氨的氣味。熔點－114.7℃，沸點89.3℃，相對密度0.7275（20／4℃）。溶於水和乙醇、乙醚等有機溶劑。三乙胺有堿性，與無機酸能生成易溶於水的鹽類。可由N，N- 二乙基乙酰氨與氫化鋁鋰反應製取，也可用乙醇胺進行氣相烷基化反應合成。用於製橡膠硫化促進劑、潤濕劑和殺菌劑等，也可用作溶劑和用於合成四級銨化合物)。
3. 如何選擇緩衝液PH值在選擇緩衝液PH值之前，應先了解被分析物的Pka，高於或低於Pka兩個PH值單位的，有助於獲得好的、尖銳的峰，從HH公式：PH＝Pka＋log（[A-]/[A]）得知，溶液PH值高於或低於Pka兩個單位，化合物中99％以一種形式存在，而一種形式存在的化合物才能獲得好的尖銳的峰。顯示的是它的離子形式和中性化合物的轉變，苯甲酸的Pka等於4.2，理論上由HH公示得知，當溶液PH值等於2.2時，99％的苯甲酸以中性化合物存在，PH值等於6.2時99%的苯甲酸以離子形式存在，所以當緩衝液PH值等於2.2時，中性化合物以羧酸形式保留於反相柱，表1列出了一般緩衝液和他們的緩衝範圍。從表1知磷酸鹽和檸檬酸鹽緩衝液能用於PH值等於2.2。
當化合物隻有氨基時，緩衝體係的選擇十分簡單，大多數氨基化合物在PH值小於9時都被質子化，所以所有PH值在7或更低的溶液均適合應用，你也許會問水的PH值大約是7，為什麼還用緩衝鹽，因為緩衝鹽有助於增加方法的可靠性，以及色譜峰的尖銳性，PH值的降低有助於氨基化合物保留的減弱，減小化合物與矽膠表麵矽羥基的作用，而使峰更尖銳，從表1 可知，任何緩衝液均可應用於氨基化合物的分析，但我們認為PH值等於3的磷酸鉀鹽最適合用於氨基化合物的分析。
在上麵兩個例子中，PH＝3delinsuanjiayandounenghuodelianghaodeyingyong，zaiyibanqingkuangxia，tashihansuojiheanjihuahewufenxizhongzuihaodehuanchongye，bingqiewomenrenweizaianjihuahewufenxizhongjiayanbinayangenghao。
4．流動相的脫氣
HPLC所用流動相必須預先脫氣，否則容易在係統內逸出氣泡，影響泵的工作。氣泡還會影響柱的分離效率，影響檢測器的靈敏度、基線穩定性，甚至使無法檢測。（噪聲增大，基線不穩，突然跳動）。此外，溶解在流動相中的氧還可能與樣品、流動相甚至固定相（如烷基胺）反應。溶解氣體還會引起溶劑pH的變化，對分離或分析結果帶來誤差。溶解氧能與某些溶劑（如甲醇、四氫呋喃）形成有紫外吸收的絡合物，此絡合物會提高背景吸收（特別是在260nm以下），並導致檢測靈敏度的輕微降低，但更重要的是，會在梯度淋洗時造成基線漂移或形成鬼峰（假峰）。在熒光檢測中，溶解氧在一定條件下還會引起淬滅現象，特別是對芳香烴、脂肪醛、酮等。在某些情況下，熒光響應可降低達95%。在電化學檢測中（特別是還原電化學法），氧的影響更大。
除去流動相中的溶解氧將大大提高UV檢測器的性能，也將改善在一些熒光檢測應用中的靈敏度。常用的脫氣方法有：加熱煮沸、抽真空、超聲、吹氦等。
對混合溶劑，若采用抽氣或煮沸法，則需要考慮低沸點溶劑揮發造成的組成變化。
超聲脫氣比較好，10~20分鍾的超聲處理對許多有機溶劑或有機溶劑/水混合液的脫氣是足夠了（一般500ml溶液需超聲20~30min方可），此法不影響溶劑組成。超聲時應注意避免溶劑瓶與超聲槽底部或壁接觸，以免玻璃瓶破裂，容器內液麵不要高出水麵太多。
離線（係統外）脫氣法不能維持溶劑的脫氣狀態，在你停止脫氣後，氣體立即開始回到溶劑中。在1~4小時內，溶劑又將被環境氣體所飽和。
在線（係統內）脫(tuo)氣(qi)法(fa)無(wu)此(ci)缺(que)點(dian)。最(zui)常(chang)用(yong)的(de)在(zai)線(xian)脫(tuo)氣(qi)法(fa)為(wei)鼓(gu)泡(pao)，即(ji)在(zai)色(se)譜(pu)操(cao)作(zuo)前(qian)和(he)進(jin)行(xing)時(shi)，將(jiang)惰(duo)性(xing)氣(qi)體(ti)噴(pen)入(ru)溶(rong)劑(ji)中(zhong)。嚴(yan)格(ge)來(lai)說(shuo)，此(ci)方(fang)法(fa)不(bu)能(neng)將(jiang)溶(rong)劑(ji)脫(tuo)氣(qi)，它(ta)隻(zhi)是(shi)用(yong)一(yi)種(zhong)低(di)溶(rong)解(jie)度(du)的(de)惰(duo)性(xing)氣(qi)體(ti)（通常是氦）將空氣替換出來。此外還有在線脫氣機。
yibanshuolaiyoujirongjizhongdeqitiyituochu，ershuirongyezhongdeqitijiaowangu。zairongyezhongchuihaishixiangdangyouxiaodetuoqifangfa，zhezhonglianxutuoqifazaidianhuaxuejianceshijingchangshiyong。danhaiqianggui，nanyupuji。
5．流動相的濾過所有溶劑使用前都必須經0.45μm（或0.22μm）濾過，以除去雜質微粒，色譜純試劑也不例外（除非在標簽上標明“已濾過”）。用濾膜過濾時，特別要注意分清有機相（脂溶性）濾膜和水相（水溶性）lvmo。youjixianglvmoyibanyongyuguolvyoujirongji，guolvshuirongyeshiliusudihuolvbudong。shuixianglvmozhinengyongyuguolvshuirongye，yanjinyongyuyoujirongji，fouzelvmohuibeirongjie！溶有濾膜的溶劑不得用於HPLC。duiyuhunheliudongxiang，kezaihunheqianfenbielvguo，ruxuhunhehoulvguo，shouxuanyoujixianglvmo。xianzaiyiyouhunhexinglvmochushou。liudongxiangdezhucunliudongxiangyibanzhucunyuboli、聚四氟乙烯或不鏽鋼容器內，不能貯存在塑料容器中。因許多有機溶劑如甲醇、乙酸等可浸出塑料表麵的增塑劑，導致溶劑受汙染。這種被汙染的溶劑如用於HPLC係統，可能造成柱效降低。貯存容器一定要蓋嚴，防止溶劑揮發引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶入流動相。
磷酸鹽、乙酸鹽緩衝液很易長黴，應盡量新鮮配製使用，不要貯存。如確需貯存，可在冰箱內冷藏，並在3天內使用，用前應重新濾過。容器應定期清洗，特別是盛水、緩衝液和混合溶液的瓶子，以除去底部的雜質沉澱和可能生長的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子無此現象。
6．鹵代有機溶劑應特別注意的問題鹵代溶劑可能含有微量的酸性雜質，能與HPLC係統中的不鏽鋼反應。鹵代溶劑與水的混合物比較容易分解，不能存放太久。鹵代溶劑（如CCl4、CHCl3等）與各種醚類（如乙醚、二異丙醚、四氫呋喃等）混合後，可能會反應生成一些對不鏽鋼有較大腐蝕性的產物，這種混合流動相應盡量不采用，或新鮮配製。此外，鹵代溶劑（如CH2Cl2）與一些反應性有機溶劑（如乙腈）混合靜置時，還會產生結晶。總之，鹵代溶劑最好新鮮配製使用。如果是和幹燥的飽和烷烴混合，則不會產生類似問題。
文章（文字）來源：化學分析計量
