高效液相色譜法按分離機製的不同分為液固吸附色譜法
、液液分配色譜法(正相與反相)、離子交換色譜法、離子對色譜法及分子排阻色譜法，這些方法在使用的過程中往往會遇到諸如鬼峰
、基線漂移、拖尾、分叉峰
、保留時間漂移
、柱壓過高等係列問題，如何解決這些問題呢?
1.用HPLC進行分析時保留時間有時發生漂移
，有時發生快速變化
，原因何在?如何解決?
關於漂移問題：

①溫度控製不好
，解決方法是采用恒溫裝置，保持柱溫恒定;

②流動相發生變化
，解決辦法是防止流動相發生蒸發、反應等;

③柱子未平衡好，需對柱子進行更長時間的平衡;

關於快速變化問題

①流速發生變化
，解決辦法是重新設定流速，使之保持穩定;

②泵中有氣泡，可通過排氣等操作將氣泡趕出;

③流動相不合適，解決辦法為改換流動相或使流動相在控製室內進行適當混合;

2.液相色譜中峰出現拖尾或出現雙峰的原因是什麼?

①篩板堵塞或柱失效，解決辦法是反向衝洗柱子
，替換篩板或更換柱子;

②存在幹擾峰，解決辦法為使用較長的柱子

，改換流動相或更換選擇性好的柱子;

③可能柱超載，減少進樣量;

3.HPLC靈敏度不夠的主要原因及解決辦法

①樣品量不足
，解決辦法為增加樣品量;

②樣品未從柱子中流出。可根據樣品的化學性質改變流動相或柱子;

③樣品與檢測器不匹配。根據樣品化學性質調整波長或改換檢測器;

④檢測器衰減太多。調整衰減即可;

⑤檢測器時間常數太大，解決辦法為降低時間參數;

⑥檢測器池窗汙染。解決辦法為清洗池窗;

⑦檢測池中有氣泡。解決辦法為排氣;

⑧記錄儀測壓範圍不當。調整電壓範圍即可;

⑨流動相流量不合適。調整流速即可;

⑩檢測器與記錄儀超出校正曲線。解決辦法為檢查記錄儀與檢測器，重作校正曲線。

4.做HPLC分析時
，柱壓不穩定，原因何在?如何解決?

①泵內有空氣，解決的辦法是清除泵內空氣，對溶劑進行脫氣處理;

②比例閥失效，更換比例閥即可;

③泵密封墊損壞，更換密封墊即可;

④溶劑中的氣泡，解決的辦法是對溶劑脫氣
，必要時改變脫氣方法;

⑤係統檢漏，找出漏點
，密封即可;

⑥梯度洗脫，這時壓力波動是正常的。

5.我最近更換了另一種牌號的ODS柱，雖然分離情況仍可以
，但保留時間不能重現，為什麼?

這是因為被分析物可能具有形成氫鍵的能力，盡管過去幾年來

，填料的製造技術有了極大的提高，但不同的廠商的ods填料表麵矽醇基的濃度不同。正是這些矽醇基可能與樣品發生相互作用。因此，同一被分析物中的各組分在不同牌號的ods柱上的相對保留時間就可能不同。在流動相中加入少量競爭物，如，三乙基胺(tea)
，jianghuishiguichunjidechengjiannenglibaohe
，congernengbaozhengbutongpaihaozhuzishangdexiangduibaoliushijianjuyoujiaohaodezhongxianxing。rufenliqingkuangkeyi
，xitongwending，dadaoxitongshiyongxingyaoqiu，jiububibaoliushijiandezhongxian。

6.我購買的HPLC柱驗收測試時柱壓過高，請問為什麼?

柱壓過高是HPLC柱用戶最常碰到的問題。其原因有多方麵，而且常常並不是柱子本身的問題，您可按下麵步驟檢查問題的起因：

①拆去保護預柱，看柱壓是否還高
，否則是保護柱的問題，若柱壓仍高
，再檢查;

②把色譜柱從儀器上取下，看壓力是否下降，否則是管路堵塞
，需清洗
，若壓力下降，再檢查;

③將柱子的進出口反過來接在儀器上，用10倍柱體積的流動相衝洗柱子，(此時，不要連接檢測器，以防固體顆粒進入流動池)。這時，如果柱壓仍不下降，再檢查;隻用於使用過的柱子。

④更(geng)換(huan)柱(zhu)子(zi)入(ru)口(kou)篩(shai)板(ban)
，若(ruo)柱(zhu)壓(ya)下(xia)降(jiang)，說(shuo)明(ming)您(nin)的(de)溶(rong)劑(ji)或(huo)樣(yang)品(pin)含(han)有(you)顆(ke)粒(li)雜(za)質(zhi)，正(zheng)是(shi)這(zhe)些(xie)雜(za)質(zhi)將(jiang)篩(shai)板(ban)堵(du)塞(sai)引(yin)起(qi)壓(ya)力(li)上(shang)升(sheng)。若(ruo)柱(zhu)壓(ya)還(hai)高(gao)，請(qing)與(yu)廠(chang)商(shang)聯(lian)係(xi)。一(yi)般(ban)情(qing)況(kuang)下(xia)，在(zai)進(jin)樣(yang)器(qi)與(yu)保(bao)護(hu)柱(zhu)之(zhi)間(jian)接(jie)一(yi)個(ge)在(zai)線(xian)過(guo)濾(lv)器(qi)便(bian)可(ke)避(bi)免(mian)柱(zhu)壓(ya)過(guo)高(gao)的(de)問(wen)題(ti)。

7.色譜雙峰產生的可能及判斷和處理?

HPLC分析中
，在色譜柱正常，樣品靈敏度足夠

，分析方法合適，色譜峰在出峰時間較短的條件下(不包括梯度)
，fengxingyingduichengerjianrui。danshi，zaiduiyangpinlejiechengdubugou
，fangfabutuo，yangpinchulifangfajijinyangfangshibuhelixia
，huichuxiangezhongyixiangbudaodewenti，erduisepufengnanyizuochuhelidejieshi，youqiduiyuxinshougengshiruci。xiamiangenjubenrenjiniangongzuodetihui，tichuyixiekanfa
，xiangtongrenzhijiao。sepushuangfengzhideshimingshiyizhongwuzhi，danzaiseputuzhongchuxianshuangfeng，erbiaominghanerzhongwuzhi。wojiangzhezhongqingkuangfenweisizhongyuanyin。

①色譜柱

如果你分析樣品時發現每個色譜峰都雙峰出現(出峰越快，雙峰的可能性會減少)，尤其采用單一純物質時
，可以肯定色譜柱出問題-柱zhu頭tou受shou損sun或huo柱zhu頭tou固gu定ding相xiang變bian髒zang或huo流liu失shi。如ru果guo進jin樣yang量liang少shao，原yuan來lai色se譜pu柱zhu正zheng常chang，色se譜pu峰feng的de形xing狀zhuang多duo為wei一yi大da峰feng帶dai一yi小xiao峰feng，不bu一yi定ding拖tuo尾wei，這zhe一yi般ban應ying是shi柱zhu頭tou受shou堵du
，將jiang色se譜pu柱zhu反fan過guo來lai接jie，用yong流liu動dong相xiang衝chong洗xi或huo酸suan洗xi或huo其qi它ta溶rong劑ji
，將jiang堵du在zai柱zhu頭tou的de殘can留liu物wu衝chong掉diao，再zai反fan過guo來lai
，一yi般ban情qing況kuang下xia就jiu行xing了le。當dang然ran不bu反fan衝chong
，正zheng衝chong有you時shi也ye會hui正zheng常chang的de。如ru果guo峰feng拖tuo尾wei，雙shuang峰feng強qiang弱ruo相xiang差cha不bu大da
，柱zhu頭tou固gu定ding相xiang變bian髒zang或huo流liu失shi可ke能neng性xing更geng大da，這zhe是shi可ke以yi將jiang進jin樣yang那na頭tou擰ning開kai，將jiang微wei孔kong濾lv片pian超chao聲sheng
，柱zhu頭tou刮gua去qu一yi部bu分fen填tian料liao，重zhong新xin填tian上shang新xin填tian料liao擰ning緊jin，不bu過guo這zhe種zhong活huo，需xu要yao一yi定ding技ji術shu，同tong時shi不bu能neng老lao幹gan那na種zhong事shi，否fou則ze用yong不bu了le幾ji次ci，色se譜pu柱zhu就jiu會hui應ying柱zhu效xiao很hen低di而er報bao廢fei。

②溶劑極性及進樣量：

許多HPLC分析者對此可能不以為然，一般的HPLC的書籍和文獻都不會提到這方麵的內容
，而這確是雙峰產生的一個很重要的原因。目前
，HPLC分析多為反相色譜，流動相多為甲醇、乙腈、水shui

，加jia各ge種zhong添tian加jia劑ji以yi改gai善shan分fen離li性xing能neng。樣yang品pin一yi般ban用yong與yu流liu動dong相xiang相xiang溶rong的de溶rong劑ji溶rong解jie。最zui佳jia的de溶rong解jie方fang法fa是shi用yong流liu動dong相xiang溶rong解jie，但dan是shi很hen多duo情qing況kuang是shi不bu一yi致zhi的de。當dang用yong溶rong劑ji極ji性xing強qiang度du大da的de試shi劑ji，如ru，純chun甲jia醇chun、純乙腈
，純乙醇，而分析體係中以水為主
，樣品進樣量大
，如，定量管為20μL，此條件下完全可以肯定，單一的純物質出雙峰，第二峰比第一峰小(每次都不太一樣)，且拖尾，保留時間會提前(相對進樣量少而言)，將(jiang)進(jin)樣(yang)量(liang)減(jian)少(shao)一(yi)半(ban)以(yi)上(shang)，峰(feng)型(xing)將(jiang)變(bian)為(wei)正(zheng)常(chang)。這(zhe)是(shi)樣(yang)品(pin)的(de)溶(rong)劑(ji)與(yu)流(liu)動(dong)相(xiang)極(ji)性(xing)相(xiang)差(cha)太(tai)大(da)

，而(er)流(liu)動(dong)相(xiang)來(lai)不(bu)及(ji)將(jiang)其(qi)稀(xi)釋(shi)達(da)到(dao)平(ping)衡(heng)造(zao)成(cheng)的(de)。上(shang)麵(mian)提(ti)到(dao)進(jin)樣(yang)量(liang)造(zao)成(cheng)雙(shuang)峰(feng)的(de)一(yi)個(ge)原(yuan)因(yin)，另(ling)一(yi)個(ge)原(yuan)因(yin)是(shi)
，進(jin)樣(yang)量(liang)不(bu)一(yi)定(ding)大(da)，但(dan)絕(jue)對(dui)量(liang)很(hen)大(da)，色(se)譜(pu)圖(tu)上(shang)的(de)雙(shuang)峰(feng)緊(jin)靠(kao)在(zai)一(yi)起(qi)，基(ji)本(ben)上(shang)齊(qi)高(gao)，不(bu)拖(tuo)尾(wei)(如果出峰很快，也可能是色譜柱問題)。將樣品稀釋再進樣就可以了，這是由於進樣量過大，色譜柱過載造成的。

③樣品的特性

youxieyangpinyouyuqihuaxuejiegoudetedian
，cunzaihubianyigouxianxiang
，erzhezhonghubianyigoutiwufafenkai，ershiyiyigedongtaipinghengcunzai。zaisepufenxishi，zaiyigetedingdetiaojianxia，yizhongwuzhijiangchuxianshuangfeng，shuangfengkaodehenjin，jibenqigao，butuowei
，tiaojianshaoyibianhua，youqipH
，雙峰現象將消失
，如
，紅黴素等。有的樣品紫外的色譜圖上看不到雙峰，但在LC-MS下
，用質譜檢測器
，其質譜的總離子流圖上較明顯，例如，我分析過的農藥啶蟲眯(吡蟲清)。

④參數

記錄的參數一般都內定的，不必修改
，但GC和HPLC的參數是不完全一致的，例如，c-r3a數據記錄儀上的一般記錄時間間隔GC為2MS，HPLC為5MS，如果記錄間隔時間縮短

，一個峰將變為二個峰或更多。

8.色譜柱中的流動相會排幹嗎?

不少做色譜分離試驗的人遇到過這樣的情形：不慎未及時補充流動相，泵將溶劑瓶中的流動相吸幹了，HPLC係統由此而停止工作了。如此情況是否會損壞色譜柱?泵是否已將色譜柱中所有流動相都排幹了?色譜柱還能使用嗎?事shi實shi上shang，如ru果guo泵beng將jiang溶rong劑ji瓶ping中zhong的de流liu動dong相xiang吸xi幹gan，並bing不bu會hui造zao成cheng色se譜pu柱zhu的de損sun壞huai。即ji使shi泵beng中zhong充chong滿man了le空kong氣qi，泵beng也ye不bu會hui將jiang空kong氣qi排pai入ru色se譜pu柱zhu。因yin為wei泵beng隻zhi能neng輸shu送song液ye體ti，而er不bu能neng輸shu送song空kong氣qi


相xiang比bi之zhi下xia，另ling一yi個ge更geng可ke能neng發fa生sheng的de情qing況kuang是shi忘wang記ji蓋gai上shang色se譜pu柱zhu兩liang端duan的de密mi封feng蓋gai或huo蓋gai子zi太tai鬆song而er使shi色se譜pu柱zhu變bian幹gan。同tong樣yang，整zheng個ge色se譜pu柱zhu幹gan涸he的de情qing況kuang不bu太tai容rong易yi發fa生sheng
，多duo半ban可ke能neng隻zhi是shi色se譜pu柱zhu兩liang端duan的de幾ji個ge毫hao米mi變bian幹gan了le，因yin揮hui發fa掉diao所suo有you溶rong劑ji是shi色se譜pu柱zhu變bian幹gan需xu要yao相xiang當dang長chang的de時shi間jian。即ji使shi色se譜pu柱zhu真zhen的de變bian幹gan了le

，也ye不bu一yi定ding就jiu不bu可ke救jiu藥yao了le。可ke以yi嚐chang試shi用yong一yi種zhong完wan全quan脫tuo氣qi的de、表麵張力低的溶劑(如經氦氣脫氣的甲醇)衝洗色譜柱以除去氣體。較低的表麵張力有助於浸潤填料表麵;已脫氣的溶劑應該能夠溶解並去除滯留在填料中的氣體。色譜柱大約需要(以1mL/min的流速)衝一個小時或更多的時間被徹底浸潤，恢複到正常狀態。

9.使用peek(poly etheretherketone)管路和接頭需要注意什麼問題?

如果經常需要改變流路或更換不同品牌的色譜柱，使用peek材料製成的管路和接頭會非常方便。peek管路容易連接;peek接頭不僅無需工具，手擰即可固定
，而且容易調節錐箍之外的管路長度，方便與不同品牌或規格的色譜柱相連接。

使用此類材料的管路需要注意的是：peek對鹵代烷烴和四氫呋喃的兼容性不好。雖然未觀察到上述溶劑溶解peek材料的明顯跡象，但

，peek遇到上述溶劑會變脆。另一個西藥考慮的因素是壓力限。不鏽鋼管可耐受6000psi的壓力，但peek管隻能耐受近4000psi(但多數hplc應用係統壓力不會超過3000psi)。

使用peek接頭時則無需擔心接頭耐溶劑性能，因為接頭幾乎或很少與溶劑直接接觸。但手擰固定的peek接頭壓力限低於不鏽鋼管，因而壓力太高時
，可能會使接頭在管路上滑動而產生死體積或漏液。

10. 液相色譜梯度洗脫中柱溫的影響

許(xu)多(duo)色(se)譜(pu)工(gong)作(zuo)者(zhe)在(zai)操(cao)作(zuo)液(ye)相(xiang)色(se)譜(pu)時(shi)，色(se)譜(pu)柱(zhu)是(shi)在(zai)室(shi)溫(wen)環(huan)境(jing)下(xia)工(gong)作(zuo)的(de)。如(ru)果(guo)實(shi)驗(yan)室(shi)的(de)溫(wen)度(du)能(neng)保(bao)持(chi)不(bu)變(bian)的(de)話(hua)，不(bu)會(hui)有(you)什(shen)麼(me)大(da)問(wen)題(ti)。但(dan)大(da)多(duo)數(shu)的(de)工(gong)作(zuo)環(huan)境(jing)溫(wen)度(du)是(shi)不(bu)斷(duan)變(bian)化(hua)的(de)，因(yin)此(ci)若(ruo)想(xiang)將(jiang)在(zai)某(mou)實(shi)驗(yan)室(shi)開(kai)發(fa)的(de)一(yi)種(zhong)液(ye)相(xiang)色(se)譜(pu)方(fang)法(fa)應(ying)用(yong)到(dao)其(qi)他(ta)實(shi)驗(yan)室(shi)的(de)話(hua)，溫(wen)度(du)的(de)差(cha)別(bie)就(jiu)會(hui)引(yin)起(qi)較(jiao)複(fu)雜(za)的(de)問(wen)題(ti)。溫(wen)度(du)的(de)影(ying)響(xiang)在(zai)所(suo)有(you)的(de)色(se)譜(pu)分(fen)析(xi)方(fang)式(shi)中(zhong)都(dou)是(shi)存(cun)在(zai)的(de)，本(ben)文(wen)就(jiu)來(lai)討(tao)論(lun)液(ye)相(xiang)色(se)譜(pu)方(fang)法(fa)中(zhong)的(de)梯(ti)度(du)洗(xi)脫(tuo)方(fang)式(shi)受(shou)溫(wen)度(du)影(ying)響(xiang)的(de)問(wen)題(ti)。

等度保留

大多數色譜工作者知道等度洗脫時溫度會影響保留時間。圖1xianshilesangebutongwenduxiadefenlijieguo。womenfaxiandangwendushenggaoshisuoyoudesepufengdouqianyile，dengduxituoshiyibanwendumeishenggaoyisheshidubaoliushijianhuisuoduan1-3%，在圖1中
，保留時間變化率約為2%/℃。

擁yong有you溫wen控kong係xi統tong的de實shi驗yan室shi一yi般ban都dou有you全quan天tian候hou溫wen控kong設she置zhi，但dan這zhe種zhong設she置zhi可ke能neng引yin起qi室shi溫wen顯xian著zhu變bian化hua，這zhe對dui整zheng夜ye運yun行xing的de色se譜pu係xi統tong就jiu會hui有you一yi些xie影ying響xiang，例li如ru

，我wo們men實shi驗yan室shi的de夜ye間jian溫wen度du就jiu設she為wei4～7℃。在不同的季節
，實驗室的夜間溫度可能比正常工作日的溫度高或低，這種溫度的變化就會使色譜峰離開“保留時間窗”，造成連續進樣中產生一係列的無效數據。

haiyouyigekenengdewenduyingxiangyinsujiushisepuyiqizaishiyanshideweizhi。dangsepuzhuzhengduizhekongtiaodesongfengkoushi
，suiranzhenggeshiyanshidewendufeichangwending，dansepuxitongdewendujiuhuibuduandebianhua。zhejiushiwomenyaoshiyongzhuwenxiangdeyuanyinzhiyi。

梯度保留

溫度變化對梯度洗脫和等度洗脫的影響趨勢是一樣的。圖2是苯胺和苯酸在三個溫度條件下的色譜圖。圖1中，20℃的溫度變化引起保留因子的變化大約為兩倍
，然而在圖2中
，40℃的變化使保留改變了約20%。平均來說，圖2中的色譜保留變化約為0.2%/℃。由此可見
，溫度變化對梯度洗脫的影響要小於對等度洗脫的影響(假定本例具有普遍代表意義)。即便如此，若梯度洗脫時不控製溫度的話，保留值一般都會有較大的變化。

結論

womenfaxianzhuwenzaiyexiangseputiduxituoguochengzhongbanyanleyigezhongyaodejiaose
，shouxian

，tigaozhuwenkeyisuoduanbaoliushijian，qici，womenkandaozhuwenhaikeyiyingxiangxuanzexing

，zuihou


，wendudebupinghenghuidaozhifengniuqubianxing。zhexietixingwomen，ruguoxiangdedaowendingkekaodefenlijieguo，sepuzhudewendubianhuashibukehushide。

11.為何會基線漂移

原因

①柱溫波動。(即使是很小的溫度變化都會引起基線的波動。通常影響示差檢測器、電導檢測器、較低靈敏度的紫外檢測器或其它光電類檢測器。)

②流動相不均勻。(流動相條件變化引起的基線漂移大於溫度導致的漂移。)

③流通池被汙染或有氣體;

④檢測器出口阻塞。(高壓造成流通池窗口破裂，產生噪音基線);

⑤流動相配比不當或流速變化;

⑥柱平衡慢，特別是流動相發生變化時;

⑦流動相汙染、變質或由低品質溶劑配成;

⑧樣品中有強保留的物質(高k’值)以饅頭峰樣被洗脫出，從而表現出一個逐步升高的基線。

⑨使用循環溶劑，不提倡。未調整檢測器。

⑩檢測器沒有設定在最大吸收波長處。

解決方法


①控製好柱子和流動相的溫度
，在檢測器之前使用熱交換器;

②使用HPLC級的溶劑，高純度的鹽和添加劑。流動相在使用前進行脫氣，使用中使用在線脫氣或氦氣脫氣。

③用甲醇或其他強極性溶劑衝洗流通池
，如有需要，可以用1n的硝酸。(不要用鹽酸)

④取出阻塞物或更換管子。參考檢測器手冊更換流通池窗。

⑤更改配比或流速。為避免這個問題可定期檢查流動相組成及流速。

⑥用中等強度的溶劑進行衝洗，更改流動相時，在分析前用10～20倍體積的新流動相對柱子進行衝洗。使用離子對試劑
、緩衝鹽更應注意平衡柱。

⑦檢查流動相的組成。使用高品質的化學試劑及HPLC級的溶劑

⑧改變分析條件。使用保護柱，如有必要
，在進樣之間或在分析過程中，定期用強溶劑衝洗柱子。

⑨重新設定基線。使用新的流動相。

⑩將波長調整至最大吸收波長處。重選檢測波長。

12.規則的基線噪音是如何產生的

原因

①在流動相、檢測器或泵中有空氣(尖銳峰)。

②漏液。

③流動相混合不完全


④溫度影響(柱溫過高
，檢測器未加熱)

⑤在同一條線上有其他電子設備(偶然噪聲)

⑥泵振動 。

解決方法

①流動相脫氣。衝洗係統以除去檢測器或泵中的空氣。

②檢查管路接頭是否鬆動，泵是否漏液，是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要，更換泵密封。

③用手搖動使混合均勻或使用低粘度的溶劑

④減少差異或加上熱交換器

⑤斷開lc、檢測器和記錄儀，檢查幹擾是否來自於外部，加以更正。采用精密級穩壓電源。

⑥在係統中加入脈衝阻尼器

13.不規則的基線噪音是如何產生的

原因

①漏液。

②流動相汙染、變質或由低質溶劑配成

③流動相各溶劑不相溶

④檢測器/記錄儀電子元件的問題

⑤係統內有氣泡

⑥檢測器內有氣泡

⑦流通池汙染(即使是極少的汙染物也會產生噪音。

⑧檢測器燈能量不足

⑨色譜柱填料流失或阻塞

⑩流動相混合不均勻或混合器工作不正常

解決方法

①檢查接頭是否鬆動，泵是否漏液，是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要，更換密封。檢查流通池是否漏液。

②檢查流動相的組成。

③選擇互溶的流動相

④斷開檢測器和記錄儀的電源，檢查並更正。

⑤用強極性溶液清洗係統

⑥清洗檢測器，在檢測器後麵安裝背景壓力調節器

⑦用1n的硝酸(不能用磷酸)清洗流通池

⑧更換燈

⑨更換色譜柱

⑩維修或更換混合器
，在流動相不走梯度時，建議不使用泵的混合裝置

14.保留時間漂移的故障排除

保留時間不重現有兩種不同的情況：既ji保bao留liu時shi間jian漂piao移yi和he保bao留liu時shi間jian波bo動dong。前qian者zhe是shi指zhi保bao留liu時shi間jian僅jin沿yan單dan方fang向xiang發fa生sheng變bian化hua，而er後hou者zhe指zhi保bao留liu時shi間jian無wu固gu定ding規gui律lv的de波bo動dong。將jiang此ci兩liang種zhong情qing況kuang區qu分fen開kai來lai對dui找zhao到dao問wen題ti的de原yuan因yin往wang往wang很hen有you幫bang助zhu。如ru
，保bao留liu時shi間jian的de漂piao移yi往wang往wang由you柱zhu老lao化hua引yin起qi;而柱老化不可能引起保留時間的無規律波動。事實上，保留時間漂移的多半原因是不同機理的色譜柱老化，如固定相流失(例如，通過水解)，色譜柱汙染(由樣品或流動相所致)等。保留時間漂移的幾種最常見的原因如下：

(1)色譜柱平衡

如果我們觀察到保留時間漂移，首先應考慮色譜柱是否已用流動相完全平衡。通常平衡需要10～20個柱體積的流動相，但如果在流動相中加入少量添加劑(如，離子對試劑)則需要相當長的時間來平衡色譜柱。

流動相汙染也可能是原因之一。溶於流動相中的少量汙染物可能慢慢富集到色譜柱上，從而造成保留時間的漂移。應注意：水是很容易汙染的流動相成分。

(2)固定相穩定性

固定相的穩定性都是有限的，即使在推薦的pH範圍內使用，固定相也會慢慢水解。例如，矽膠基質在pH=4時水解穩定性最好。水解速度與流動相類型和配體有關。雙官能團配體和三官能團配體比單官能團配體的鍵合相要穩定;長鏈鍵合相比短鏈鍵合相穩定;烷基鍵合相比氰基鍵合相穩定的多。

經常清洗色譜柱亦會加速色譜柱固定相的水解。其他矽膠基質鍵合相在水溶液環境中也可以發生水解，如，氨基鍵合相等。

(3)色譜柱汙染

保留時間漂移的另一個常見原因是色譜柱汙染。HPLC色譜柱是非常有效的吸附性過濾器，它可以過濾並吸附流動相攜帶的任何物質。汙染源可以是：流動相本身，流動相容器
，連接管、泵、進樣器和儀器密封墊，以及樣品等。通常通過實驗可判斷汙染的來源。

樣(yang)品(pin)中(zhong)如(ru)果(guo)存(cun)在(zai)色(se)譜(pu)柱(zhu)上(shang)保(bao)留(liu)很(hen)強(qiang)的(de)組(zu)分(fen)

，就(jiu)可(ke)能(neng)是(shi)使(shi)保(bao)留(liu)時(shi)間(jian)漂(piao)移(yi)的(de)潛(qian)在(zai)根(gen)源(yuan)。這(zhe)些(xie)根(gen)源(yuan)通(tong)常(chang)是(shi)樣(yang)品(pin)基(ji)質(zhi)，如(ru)，配(pei)藥(yao)中(zhong)的(de)賦(fu)形(xing)劑(ji)
，生(sheng)化(hua)樣(yang)品(pin)(如
，血清)zhongdedanbaijileizhileihuahewu，shipinyangpinzhongdedianfen，huanjingshuiyangzhongdefuzhisuandeng。tongchangyangpinzhongdeqiangbaoliuzufenjuyoujiaogaodefenziliang，zaiciqingkuangxia

，baoliushijianpiaoyidetongshihuoqihouhuiyoufanyadezengjia。keyitongguoshiyongguxiangtiqu(SPE)等樣品前處理方法來去除樣品基質的影響。

bimiansepuzhuwuranzuijiandandefangfashifanghuanyuweiran。xiangbizhixia，zhaodaowentidesuozaibingshejiyouxiaodeqingxibuzhouyiquchuwuranwuyaokunnandeduo。tongchangshiyongzaigeidingseputiaojianxiadeqiangrongji，danbingfeisuoyouwuranwudoukeyizailiudongxiangzhongrongjie，ru，thf可去除反相色譜柱中的許多汙染物
，但蛋白在thf中就不能溶解。dmso常常用於去除反相色譜柱中的蛋白。使用保護柱是個非常有效的方法。反衝色譜柱僅是不得已時采用的辦法。

(4)流動相組成

流動相組成的緩慢變化也是保留時間漂移的常見原因。如流動相中易揮發組分的揮發及循環使用流動相等。

(5)疏水坍塌

當小孔徑、端基封口良好的反相填料色譜柱使用接近100%的de水shui為wei流liu動dong相xiang時shi，有you時shi會hui發fa生sheng分fen離li突tu然ran喪sang失shi及ji被bei分fen析xi物wu質zhi保bao留liu明ming顯xian降jiang低di或huo完wan全quan不bu保bao留liu的de現xian象xiang
，這zhe就jiu是shi疏shu水shui坍tan塌ta。此ci現xian象xiang是shi由you流liu動dong相xiang不bu浸jin潤run固gu定ding相xiang表biao麵mian而er致zhi。挽wan救jiu的de辦ban法fa實shi現xian用yong含han大da量liang有you機ji組zu分fen的de流liu動dong相xiang浸jin潤run固gu定ding相xiang，再zai用yong高gao水shui含han量liang的de流liu動dong相xiang進jin行xing平ping衡heng。色se譜pu柱zhu長chang期qi儲chu存cun也ye會hui發fa生sheng此ci現xian象xiang。使shi用yong內nei嵌qian極ji性xing基ji團tuan的de反fan相xiang色se譜pu柱zhu(如
，waters symmetryshield rp色譜柱)或非端基封口的色譜柱(如，waters resolve色譜柱)也可避免發生坍塌。

15.為何出現肩峰或分叉?

①樣品體積過大--用流動相配樣,總的樣品體積小於第一峰的15%;

②樣品溶劑過強--采用較弱的樣品溶劑;

③柱塌陷或形成短路通道--更換色譜柱,采用較弱腐蝕性條件;

④柱內燒結不鏽鋼失效--更換燒結不鏽鋼,加在線過濾器，過濾樣品;

⑤進樣器損壞--更換進樣器轉子

16為何出現鬼峰?

①進樣閥殘餘峰--每次用後用強溶劑清洗閥
，改進閥和樣品的清洗;

②樣品中未知物--處理樣品;

③柱未平衡--重新平衡柱,用流動相作樣品溶劑(尤其是離子對色譜);

④三氟乙酸(tfa)氧化--每天新配
，用抗氧化劑;

⑤水汙染(反相)--通過變化平衡時間檢查水質量，用HPLC級的水;

17.為何出現峰拖尾?

①柱超載--降低樣品量,增加柱直徑采用較高容量的固定相;

②峰幹擾--清潔樣品
，調整流動相;

③矽羥基作用--加三乙胺，用堿致鈍化柱，增加緩衝液或鹽的濃度降低流動相pH值
，純化樣品;

④柱內燒結不鏽鋼失效--更換燒結不鏽鋼
，加在線過濾器，過濾樣品;

⑤柱塌陷或形成短路通道--更換色譜柱，采用較弱腐蝕性條件;

⑥死體積或柱外體積過大--連接點降至最低
，對所有連接點作合適調整

，盡可能采用細內徑的連接管;

⑦柱效下降--用較低腐蝕條件，更換柱
，采用保護柱;

18.為何出現峰展寬?

①樣品體積過大--用流動相配樣，總的樣品體積小於第一峰的15%;

②在進樣閥中造成峰擴展--進樣前後排出氣泡以降低擴散;

③數據係統采樣速率太慢--設定速率應是每峰大於10點;

④檢測器時間常數過大--設定時間常數為感興趣第一峰半寬的10%;

⑤流動相粘度過高--增加柱溫,采用低粘度流動相;

⑥檢測池體積過大--用小體積池,卸下熱交換器;

⑦保留時間過長--等度洗脫時增加強溶劑含量，也可用梯度洗脫;

⑧柱外體積過大--將連接管徑和連接管長度降至最小;

⑨樣品過載--進小濃度小體積樣品。

19.除了流速外，還有哪些因素能引起壓力改變?



改變流動相組成和溫度;改變柱長、柱內徑和填料粒度;柱突然阻塞壓力升高(正常情況下其它條件不變柱壓都是逐漸升高的)。



20.什麼是強溶劑、弱溶劑?



gaibianliudongxiangdezuchenghuorongjirongjiqiangdujiukeyigaibianfengrongliangyinzihebaoliushijian。zaiyidingtiaojianxia，jianshaobaoliushijianhuosuoduanfenxishijianderongjiweiqiangrongji，zengjiabaoliushijianhuoyanchangfenxishijianderongjiweiruorongji。



21.怎樣才會使峰位發生重排?



在分析多組分樣品時
，僅改變流動相的強度(組成百分比)而不改變其組成
，一般僅僅改變所有組分的保留時間
，不會發生峰位的重排。



下列條件改變可能發生峰位重排：



流動相中換了強溶劑;pH值的改變;柱填料的改變;柱溫的改變;流動相的組成改變(如，加入離子對試劑三乙基胺等)。



22.除了在線脫氣，常用的實驗室脫氣方式還有哪些?



加熱回流脫氣，脫氣效果最佳，但無法保持;氦脫氣
，此方法脫氣效果佳，能除去百分之九十以上的空氣，但氦氣價格太貴，所以用的不多;真空脫氣，效果僅次於氦脫氣，但脫氣過程中容易造成樣品溶液揮發損失;超聲脫氣
，隻能脫去約百分之三十的空氣，但，在實驗室中最常用。目前還是盡量爭取用在線脫氣，方便且效果好。



23.評價一個色譜柱的最基本指標有那些?



評介一根色譜柱的基本指標是：塔板數
、峰不對稱因子
、柱壓降

、適用範圍和鍵合相濃度以及峰容量。



24.什麼是時間常數?



時間常數實際上是響應時間的設定，起著過濾噪音的作用。時間常數太小(太快)可能增加短噪音，時間常數太大(太慢)可能出寬峰、拖尾峰。



25.為什麼在實驗過程中有時會出現倒峰?



所用的流動相在檢測波長下有吸收，而進在此波長下沒有吸收或吸收低於流動相的溶液，在流動相中會出現洞穴，通過柱後出現倒峰。



26.為何會出現“胖”峰和平頭峰?怎樣避免?

用比流動相強度大的大體積樣品進樣，通常會損害色譜圖的質量，而出現“胖”峰和平頭峰。應遵循下列規則選用溶劑溶解樣品


a.最好用流動相溶解樣品進樣


b.用(yong)大(da)體(ti)積(ji)弱(ruo)溶(rong)劑(ji)溶(rong)解(jie)樣(yang)品(pin)
，如(ru)，反(fan)相(xiang)色(se)譜(pu)中(zhong)用(yong)水(shui)溶(rong)解(jie)樣(yang)品(pin)進(jin)樣(yang)，主(zhu)要(yao)缺(que)點(dian)是(shi)每(mei)次(ci)進(jin)樣(yang)後(hou)在(zai)色(se)譜(pu)圖(tu)的(de)開(kai)頭(tou)出(chu)現(xian)大(da)的(de)負(fu)峰(feng)，有(you)時(shi)還(hai)波(bo)及(ji)到(dao)樣(yang)品(pin)峰(feng);

c.需要時用強溶劑溶解進樣。

27.什麼是次級保留效應?

在(zai)良(liang)好(hao)的(de)色(se)譜(pu)分(fen)離(li)中(zhong)
，樣(yang)品(pin)分(fen)子(zi)是(shi)以(yi)單(dan)一(yi)的(de)保(bao)留(liu)過(guo)程(cheng)被(bei)保(bao)留(liu)

，如(ru)在(zai)反(fan)相(xiang)色(se)譜(pu)中(zhong)
，溶(rong)質(zhi)與(yu)柱(zhu)填(tian)料(liao)的(de)非(fei)極(ji)性(xing)烷(wan)基(ji)鏈(lian)發(fa)生(sheng)疏(shu)水(shui)性(xing)相(xiang)互(hu)作(zuo)用(yong)，但(dan)，在(zai)以(yi)矽(gui)膠(jiao)為(wei)基(ji)質(zhi)的(de)填(tian)料(liao)中(zhong)，有(you)些(xie)樣(yang)品(pin)組(zu)分(fen)能(neng)與(yu)矽(gui)醇(chun)基(ji)團(tuan)相(xiang)互(hu)作(zuo)用(yong)
，脫(tuo)附(fu)的(de)過(guo)程(cheng)很(hen)慢(man)，使(shi)峰(feng)嚴(yan)重(zhong)拖(tuo)尾(wei)
，這(zhe)就(jiu)是(shi)次(ci)保(bao)留(liu)過(guo)程(cheng)。對(dui)付(fu)次(ci)保(bao)留(liu)效(xiao)應(ying)最(zui)有(you)效(xiao)的(de)方(fang)法(fa)就(jiu)是(shi)選(xuan)用(yong)封(feng)尾(wei)更(geng)好(hao)色(se)譜(pu)柱(zhu)或(huo)加(jia)入(ru)流(liu)動(dong)相(xiang)改(gai)良(liang)劑(ji)(也叫掃尾劑)。

28.前延峰的發生及處理?

因yin柱zhu溫wen問wen題ti很hen易yi引yin起qi前qian延yan峰feng，有you些xie樣yang品pin在zai常chang溫wen下xia分fen離li可ke見jian前qian延yan峰feng
，提ti高gao溫wen度du後hou前qian延yan峰feng的de現xian象xiang消xiao失shi。在zai離li子zi對dui色se譜pu中zhong，前qian延yan峰feng的de另ling一yi個ge原yuan因yin是shi用yong非fei流liu動dong相xiang作zuo樣yang品pin溶rong劑ji。因yin此ci在zai離li子zi對dui色se譜pu中zhong要yao求qiu僅jin用yong流liu動dong相xiang溶rong解jie樣yang品pin
，而er且qie進jin樣yang量liang不bu要yao太tai大da，否fou則ze會hui導dao致zhi前qian延yan峰feng或huo其qi它ta問wen題ti。在zairp-HPLCzhongyangpinrongyedeqiangdudayuliudongxiangyinqiqianyanfeng。zengjialiudongxiangdeqiangdu
，jianshaoyangpinrongyedeqiangdu，zailiziduisepuzhongzengjializiqiangdu，keyikefuqianyanfengdexiaoying。ciwaishiyongliudongxiangrongjieyangpinshijiejuedezuijiandanshiyongdefangfa。

29.峰變寬的原因?

a.在使用過程中柱本身退化，逐漸降低柱效;

b.柱外峰寬效應。一根很好的專用柱用於另一液相色譜係統引起塔板數降低，說明新係統有很大的柱外峰寬效應;

c.化學效應

，多數是流動相和固定相相互作用所致，改變流動相可使寬峰有所改善。

30.柱平衡慢的常見原因有哪些?

柱平衡慢的常見原因是
，組分在舊的或新的流動相中對柱吸附強，或者，在新的流動相中濃度小甚至為零：

a.流動相含有胺改良劑;

b.流動相含有離子對試劑;矽膠柱;流liu動dong相xiang中zhong有you四si氫qing呋fu喃nan。可ke考kao慮lv采cai用yong專zhuan用yong柱zhu用yong於yu特te殊shu的de方fang法fa，不bu用yong時shi將jiang柱zhu折zhe下xia來lai，注zhu滿man適shi當dang的de溶rong劑ji或huo流liu動dong相xiang，密mi封feng保bao管guan
，不bu再zai作zuo其qi它ta的de分fen析xi。



31.用內標法實驗時對內標物的要求有哪些?

a.內標物的結構或理化性質應與被分析組分相似或相近;

b.內標物的保留值應稍大於或小於被分析物的保留

，不能相差過大;

c.內標物的峰要與所有被分析物的峰有良好的分離度(r大於1.5)
，不能讓內標物成了幹擾物;

d.無結構相似的內標物，可用保留相近的內標物;

e.儀器對分析物的響應與內標基本一致，出峰麵積大小不能相差懸殊。

32.管子切割與安裝注意事項?

a.管子的斷麵必須垂直，否則，將會產生死體積而引起色譜峰峰形擴展。



b.確保管子內表麵不被損傷

，如果損傷

，可能會發生管路堵塞。

c.將管子完全插入開口端，直至其與開口端的末端相碰為止。否則
，將會產生死體積而引起色譜峰峰形擴展。

d.不要過分擰緊螺帽，以防損壞螺紋。

33.什麼是HPLC的“無限直徑效應”?

在HPLC分fen析xi中zhong由you於yu使shi用yong了le高gao效xiao微wei粒li固gu定ding相xiang及ji高gao壓ya流liu動dong相xiang，樣yang品pin以yi柱zhu塞sai式shi注zhu入ru色se譜pu柱zhu後hou，因yin柱zhu的de阻zu力li大da

，樣yang品pin分fen子zi在zai柱zhu中zhong的de分fen子zi擴kuo散san很hen小xiao
，直zhi至zhi它ta從cong色se譜pu柱zhu流liu出chu也ye未wei與yu色se譜pu柱zhu內nei壁bi接jie觸chu
，因yin而er引yin起qi的de色se譜pu峰feng形xing擴kuo展zhan很hen小xiao
，能neng保bao持chi高gao柱zhu效xiao。

34.如何評價一台檢測器?

a.噪聲：

通常噪聲是指由儀器的電氣元件、溫度波動
、電壓的線性脈衝以及其他非溶質作用產生的高頻噪聲和基線的無規則波動;

b.基線漂移：

漂移是基線的一種向上或向下的緩慢移動，可在較長時間(0.5~1h)內觀察到。它可掩蔽噪聲和小峰。漂移與整個液相色譜係統有關
，而不僅是由檢測器引起的;

c.靈敏度(最小檢出濃度或最小檢出量)：

在一個特定分離工作中
， 檢測器是否有足夠的靈敏度是十分重要的。當比較檢測器時，常使用敏感度這一性能指標。敏感度即指信號與噪聲的比值(信噪比)等於2時
，在單位時間內進入檢測器的溶質的濃度或質量。

d.線性範圍：

在進行定量分析時，希望檢測器有寬的線性範圍，以便在一次分析中可同時對主要組分和痕量組分同時進行檢測;

e.檢測器的池體積：

它應小於最早流出的死時間色譜峰的洗脫體積的1/10，否則會產生嚴重的柱外譜帶擴展。

35.如何簡單判斷比例閥是否內漏?

設定泵使用一個單獨通路(a)
，打開purge閥，流速5mL/min
，提起其他溶劑瓶內的溶劑過濾頭直至離開液麵
，觀察這些通路(b
、c
、d)內的溶劑是否隨著流動，正常時均不應流動。

文章（文字)來源：嘉峪檢測網。