一

、消毒滅菌方法

目前
，常用的消毒滅菌方法多采用物理方法(如幹熱滅菌法

、濕熱滅菌法、過濾除菌法、射線殺菌法等)和化學方法(消毒劑
、抗生素)兩大類。

1.幹熱滅菌法

是利用恒溫幹燥箱內160℃～170℃的高熱，並保持90～120分鍾
，殺死細菌和芽孢，達到滅菌目的的一種方法。主要適用於不便在壓力蒸汽滅菌器中進行滅菌，且不易被高溫損壞的玻璃器皿
、jinshuqixieyijibunenghezhengqijiechudewupindemiejun。yongcifangfamiejundewupinganzao，yiyuzhucun。jiujingdenghuoyanshaozhuomiejunfayeshishuyuganremiejundefangfazhiyi，zaijinxingweishengwujiancegongzuoshi，changxuliyonggongzuotaimianshangdejiujingdenghuoyanduijinshuqijujiboliqiminkouyuanjinxingbuchongmiejun。

2.濕熱滅菌法

壓(ya)力(li)蒸(zheng)汽(qi)濕(shi)熱(re)滅(mie)菌(jun)法(fa)是(shi)目(mu)前(qian)最(zui)常(chang)用(yong)的(de)一(yi)種(zhong)滅(mie)菌(jun)方(fang)法(fa)。它(ta)利(li)用(yong)高(gao)壓(ya)蒸(zheng)汽(qi)以(yi)及(ji)在(zai)蒸(zheng)汽(qi)環(huan)境(jing)中(zhong)存(cun)在(zai)的(de)潛(qian)熱(re)作(zuo)用(yong)和(he)良(liang)好(hao)的(de)穿(chuan)透(tou)力(li)，使(shi)菌(jun)體(ti)蛋(dan)白(bai)質(zhi)凝(ning)固(gu)變(bian)性(xing)而(er)使(shi)微(wei)生(sheng)物(wu)死(si)亡(wang)。適(shi)合(he)於(yu)布(bu)類(lei)工(gong)作(zuo)衣(yi)、各種器皿、金屬器械、膠塞、蒸餾水、棉塞、紙和培養基的滅菌。高壓蒸汽滅菌器的蒸汽壓力一般調整為0.10-0.11MPa，維持20～30min即可達到滅菌效果。

3.射線滅菌法

liyongziwaixiandengjinxingzhaoshemiejundefangfa。ziwaixianshiyizhongdinengliangdediancifushe，keyishamieduozhongweishengwu。ziwaixiandezuoyongjizhishitongguoduiweishengwudehesuanjidanbaizhidengdepohuaizuoyongershiqimiehuo。shiheyushiyanshikongqi、地麵、操作台麵滅菌。滅菌時間為30min。用yong紫zi外wai線xian殺sha菌jun時shi應ying注zhu意yi
，不bu能neng邊bian照zhao射she邊bian進jin行xing實shi驗yan操cao作zuo
，因yin為wei紫zi外wai線xian不bu僅jin對dui人ren體ti皮pi膚fu有you傷shang害hai，而er且qie對dui培pei養yang物wu及ji一yi些xie試shi劑ji等deng也ye會hui產chan生sheng不bu良liang影ying響xiang。

4.過濾除菌法
是(shi)將(jiang)液(ye)體(ti)或(huo)氣(qi)體(ti)通(tong)過(guo)有(you)微(wei)孔(kong)的(de)濾(lv)膜(mo)過(guo)濾(lv)，使(shi)大(da)於(yu)濾(lv)膜(mo)孔(kong)徑(jing)的(de)細(xi)菌(jun)等(deng)微(wei)生(sheng)物(wu)顆(ke)粒(li)阻(zu)留(liu)，從(cong)而(er)達(da)到(dao)除(chu)菌(jun)的(de)方(fang)法(fa)。過(guo)濾(lv)除(chu)菌(jun)法(fa)大(da)多(duo)用(yong)於(yu)遇(yu)熱(re)易(yi)發(fa)生(sheng)分(fen)解(jie)

、變性而失效的試劑、酶液、血清、培養基等。

目前
，常用微孔濾膜金屬濾器或塑料濾器正壓過濾除菌
，或用玻璃細菌濾器
、濾球負壓過濾除菌。濾膜孔徑應在0.22～0.45μm範(fan)圍(wei)內(nei)或(huo)用(yong)更(geng)小(xiao)的(de)細(xi)菌(jun)濾(lv)膜(mo)，溶(rong)液(ye)通(tong)過(guo)濾(lv)膜(mo)後(hou)，細(xi)菌(jun)和(he)孢(bao)子(zi)等(deng)因(yin)大(da)於(yu)濾(lv)膜(mo)孔(kong)徑(jing)而(er)被(bei)阻(zu)，並(bing)利(li)用(yong)濾(lv)膜(mo)的(de)吸(xi)附(fu)作(zuo)用(yong)
，阻(zu)製(zhi)小(xiao)於(yu)濾(lv)膜(mo)孔(kong)徑(jing)的(de)細(xi)菌(jun)透(tou)過(guo)。

5.化學消毒劑消毒法
用於那些不能利用物理方法進行滅菌的物品、空氣

、工作麵、操作者皮膚、某些實驗器皿等。常用的化學消毒劑包括甲醛
、高錳酸鉀
、70%～75%乙醇、過氧乙酸

、來蘇爾水
、0.1%新潔爾滅、環氧乙烷、碘伏或碘酊等。其中利用70%～75%乙醇、0.1%～0.2%氯化汞、10%次氯酸鈉、飽和漂白粉等進行實驗材料的滅菌
；利用甲醛加高錳酸鉀[(2mL甲醛+1g高錳酸鉀)/m3]或乙二醇(6mL/m3)等加熱熏蒸法進行無菌室和培養室的消毒。在使用時應注意安全，特別是用在皮膚或實驗材料上的消毒劑，須選用合適的藥劑種類、濃度和處理時間，才能達到安全和滅菌的目的。

6.抗生素抑菌法
主要用於培養基
，是培養過程中預防微生物汙染的重要手段以及作為微生物汙染不嚴重時的“急救”措施。常用的抗生素有青黴素、鏈黴素和新黴素等。

二、不同種類物品及培養物的消毒滅菌方法
 

1.無菌操作室滅菌
由於無菌操作室的汙染來源主要是空氣中的細菌和真菌孢子，因此長期停用後的無菌操作室應進行熏蒸滅菌
，熏蒸是用高錳酸鉀+甲醛[(2mL甲醛+1g高錳酸鉀)/m3]進行無菌室的滅菌。經常使用的無菌操作室，在每次使用前都應進行地麵衛生清潔，並用紫外線燈照射30min
，進行空氣滅菌。對超淨工作台，每次操作前用紫外燈照射30min，然後用70%～75%酒精擦拭。

2.培養液滅菌
培養液在製備過程中帶有各種雜菌，分裝後應立即滅菌
，至少也應在4小(xiao)時(shi)內(nei)完(wan)成(cheng)滅(mie)菌(jun)工(gong)序(xu)。目(mu)前(qian)常(chang)用(yong)過(guo)濾(lv)除(chu)菌(jun)法(fa)除(chu)去(qu)培(pei)養(yang)物(wu)操(cao)作(zuo)液(ye)和(he)培(pei)養(yang)液(ye)中(zhong)的(de)細(xi)菌(jun)。或(huo)對(dui)培(pei)養(yang)液(ye)中(zhong)耐(nai)熱(re)組(zu)分(fen)先(xian)進(jin)行(xing)高(gao)壓(ya)蒸(zheng)汽(qi)滅(mie)菌(jun)，然(ran)後(hou)在(zai)無(wu)菌(jun)室(shi)加(jia)入(ru)經(jing)過(guo)過(guo)濾(lv)除(chu)菌(jun)的(de)不(bu)耐(nai)熱(re)溶(rong)液(ye)，混(hun)勻(yun)後(hou)分(fen)裝(zhuang)備(bei)用(yong)。

使用高壓蒸汽滅菌器滅菌時，將分裝好的培養液放入底部有一定量(淹沒加熱管)涼水的高壓蒸汽滅菌器內

，增壓至0.035~0.040 MPa時排淨滅菌器內冷空氣，以便使蒸汽能到達各個消毒部位

，保證消毒滅菌徹底。然後繼續加壓加熱，當壓力表讀數達到0.10~0.11MPa為121℃，保持15~20min即可。由於消毒滅菌效果取決於溫度而不是壓力，所以在一定壓力下保持較長的消毒滅菌時間是必須的。

在121℃的蒸汽溫度下可以很快殺死各種細菌及高度耐熱的芽孢杆菌
，因此許多培養液的消毒滅菌壓力、溫度一般保持在0.10~0.11MPa
、121℃。消毒滅菌時間與需要消毒滅菌的培養液量密切相關(表1)

，時(shi)間(jian)不(bu)足(zu)達(da)不(bu)到(dao)滅(mie)菌(jun)效(xiao)果(guo)
，時(shi)間(jian)過(guo)長(chang)培(pei)養(yang)液(ye)內(nei)的(de)一(yi)些(xie)化(hua)學(xue)物(wu)質(zhi)遭(zao)到(dao)破(po)壞(huai)，影(ying)響(xiang)培(pei)養(yang)液(ye)成(cheng)分(fen)。消(xiao)毒(du)滅(mie)菌(jun)結(jie)束(shu)後(hou)，關(guan)閉(bi)熱(re)源(yuan)，隻(zhi)有(you)當(dang)滅(mie)菌(jun)器(qi)內(nei)壓(ya)力(li)降(jiang)為(wei)零(ling)時(shi)才(cai)能(neng)打(da)開(kai)放(fang)氣(qi)閥(fa)，排(pai)除(chu)剩(sheng)餘(yu)蒸(zheng)汽(qi)，取(qu)出(chu)培(pei)養(yang)液(ye)。不(bu)可(ke)在(zai)壓(ya)力(li)較(jiao)高(gao)時(shi)打(da)開(kai)放(fang)氣(qi)閥(fa)
，引(yin)起(qi)減(jian)壓(ya)沸(fei)騰(teng)
，使(shi)容(rong)器(qi)中(zhong)液(ye)體(ti)溢(yi)出(chu)。培(pei)養(yang)液(ye)組(zu)成(cheng)中(zhong)如(ru)含(han)有(you)遇(yu)熱(re)易(yi)分(fen)解(jie)的(de)物(wu)質(zhi)，則(ze)需(xu)用(yong)過(guo)濾(lv)方(fang)法(fa)消(xiao)毒(du)滅(mie)菌(jun)。首(shou)先(xian)對(dui)培(pei)養(yang)液(ye)中(zhong)耐(nai)熱(re)組(zu)分(fen)進(jin)行(xing)高(gao)壓(ya)蒸(zheng)汽(qi)滅(mie)菌(jun)後(hou)放(fang)置(zhi)在(zai)無(wu)菌(jun)場(chang)所(suo)
，固(gu)體(ti)培(pei)養(yang)液(ye)在(zai)40℃左右瓊脂即將凝結前，加入經過過濾除菌的不耐熱溶液，混勻後冷卻備用。

3.玻璃器皿、塑料器皿和器械滅菌

玻璃器皿可進行幹熱滅菌或高壓蒸汽滅菌，但在蒸汽滅菌後最好及時烘幹水分。對不能進行高壓蒸汽滅菌的塑料器皿可用75%jiujingjinpao，shiyongqianzaiwujuncaozuotaimianshanglianggandetongshi，yongziwaixianzhongfushajun。shiyanshihaikeyiyonghuanyangyiwanmiejundaiduisuliaoqiminjinxingxiaodu，xiaoduhoudeqiminyaochongfensanqi2～4小時後才可使用。無菌操作所用的各種器械
，一般采用幹熱或高壓蒸汽滅菌
，或用75%酒精浸泡，然後在無菌操作台麵上晾幹的同時再用紫外線重複殺菌；在使用期間可多次對其進行酒精燈火焰灼燒滅菌。

4.培養材料的消毒滅菌
采(cai)自(zi)動(dong)物(wu)機(ji)體(ti)的(de)實(shi)驗(yan)材(cai)料(liao)，攜(xie)帶(dai)著(zhe)微(wei)生(sheng)物(wu)及(ji)雜(za)質(zhi)，接(jie)種(zhong)前(qian)須(xu)進(jin)行(xing)表(biao)麵(mian)消(xiao)毒(du)滅(mie)菌(jun)，對(dui)內(nei)部(bu)已(yi)受(shou)微(wei)生(sheng)物(wu)侵(qin)染(ran)的(de)材(cai)料(liao)應(ying)予(yu)以(yi)淘(tao)汰(tai)。從(cong)動(dong)物(wu)機(ji)體(ti)采(cai)集(ji)的(de)某(mou)些(xie)組(zu)織(zhi)塊(kuai)
，須(xu)用(yong)消(xiao)毒(du)劑(ji)進(jin)行(xing)浸(jin)泡(pao)處(chu)理(li)，進(jin)行(xing)表(biao)麵(mian)消(xiao)毒(du)。常(chang)用(yong)消(xiao)毒(du)劑(ji)有(you)過(guo)氧(yang)化(hua)氫(qing)(10~12%，浸泡5~15 min)、過氧乙酸(0.05%，浸泡30s~1min)、酒精(70~75%，浸泡2 min)。

三

、滅菌程序驗證內容

撰寫驗證方案及製定評估標準。

確認滅菌設備技術資料齊全、安裝正確，並能處於正常運行。

確認關鍵設備控製儀表在規定的參數範圍內能正常運行。

采用被滅菌物品或模擬物品進行重複實驗確認滅菌效果符合規定。

完善文件記錄，撰寫驗證報告。

四、滅菌程序運行監控

關鍵參數應在驗證確定的範圍內：溫度、壓力、時間、濕度、滅菌氣體濃度
、輻照劑量等。

滅菌程序定期驗證，時效不超過半年。

滅菌設備或程序發生變更重新進行驗證。

五、滅菌保證

滅菌效果與滅菌前產品汙染程度及汙染菌特性有關，把握微生物汙染水平及汙染菌耐受性，注意各個環節降低汙染程度。

滅菌冷卻階段防止已滅菌物品再次汙染。

適用生物指示劑、化學指示劑等監控滅菌結果。

六
、生物指示劑

基本要求：

菌種的耐受性應大於需滅菌產品中所有可能汙染菌的耐受性。

菌種應無致病性。

菌株應穩定，存活期長
，易於保存。

易於培養。若使用休眠孢子
，孢子含量在90%以上。

七、常用生物指示劑

濕熱滅菌：嗜熱脂肪芽孢杆菌孢子（ATCC7953等
，活孢子數為5×105～5×106個/片)。

幹熱滅菌：枯草芽孢杆菌孢子（ATCC9372等，活孢子數為5×105～5×106個/片)。

輻射滅菌：短小芽孢杆菌孢子（ATCC27142等，活孢子數為5×107～5×108個/片)。

八
、小結

高壓蒸汽滅菌法：用高溫加高壓滅菌，不僅可殺死一般的細菌，對細菌芽胞也有殺滅效果
，是最可靠
、應用最普遍的物理滅菌法。主要用於能耐高溫的物品

，如金屬器械
、玻璃、搪瓷、敷料
、橡膠及一些藥物和部分培養基的滅菌。