1、純化的一般目標和方法

首先，自然來源或者重組表達的蛋白質經過一些粗提的步驟(例如：勻漿
、離心、硫酸銨沉澱等)成為穩定的可以用於色譜分離的樣品。

 

然後進行捕獲色譜(capture chromatography)，主要目標是濃縮和去除大量的容易去除的雜質，此步最關心的是流速和載量，常采用高載量、快流速凝膠。

 

經過濃縮的部分純化的樣品進行中級色譜(intermediate chromatography)，目的是去除較難去除的雜質
，此步最關心的是分辨率，常采用高分辨率的細顆粒凝膠。

 

最後為了得到符合要求的最終產品，去除殘存的雜質以及目的蛋白的多聚物或者降解片斷，進行精製色譜(polishing chromatography)，常采用具有高分辨率的凝膠過濾凝膠進行凝膠過濾色譜。

 

 

(1)樣品穩定性試驗a、測定樣品在pH 2-9的穩定性；b
、測定樣品在0-4 mol/L NaCl及0-2 mol/L 硫酸銨中的穩定性；c
、測定樣品在0-50%乙醇、甲醇中的穩定性；d、測定樣品在4-40℃的穩定性；e、室溫下靜置過夜，測定對蛋白水解酶的穩定性。

 

(2)樣品預處理a、去除樣品中顆粒物(0.45-0.22微米膜過濾或者10000 g離心15分鍾)

 

b、去除樣品中脂類( 10000 g離心15分鍾或有機溶劑抽提)

 

c、去除樣品中核酸(加入核酸酶消化或者使核酸沉澱)

 

d
、抑製樣品中蛋白水解酶(加入蛋白酶抑製劑、低溫下快速第一步分離或在蛋白酶缺陷宿主中表達重組蛋白)

 

(3)樣品的保存條件：短期儲存(小於24小時)

 

a、避免接近或超過樣品的穩定極限防止蛋白質變性或沉澱b、在密閉容器中冰箱冷藏較長期儲存(數天)

 

a
、b、同上c
、加入適當的抑菌劑長期儲存a、同上b
、冰凍或者最好凍幹(真空冷凍幹燥)保存。

 

3
、對每一純化步驟的評價相關方法的建立

a
、目的蛋白含量測定酶活性測定、生物活性測定
、放射免疫
、酶聯免疫、免疫電泳、熒光。

 

b、總蛋白含量測定紫外吸收法、Lowry法、Bradford染料結合法(考馬斯亮蘭G-250)等。

 

c、樣品複雜度檢測HPLC(離子交換、凝膠過濾
、反相)、SDS-PAGE
、等電聚焦、毛細管電泳(CE)。

 

(1)天然蛋白： 天(tian)然(ran)產(chan)物(wu)中(zhong)的(de)目(mu)的(de)蛋(dan)白(bai)一(yi)般(ban)含(han)量(liang)很(hen)少(shao)而(er)且(qie)組(zu)分(fen)極(ji)複(fu)雜(za)
，在(zai)分(fen)離(li)過(guo)程(cheng)中(zhong)須(xu)采(cai)用(yong)多(duo)步(bu)驟(zhou)才(cai)能(neng)去(qu)除(chu)各(ge)種(zhong)雜(za)質(zhi)，並(bing)應(ying)在(zai)整(zheng)個(ge)過(guo)程(cheng)中(zhong)降(jiang)低(di)蛋(dan)白(bai)水(shui)解(jie)酶(mei)的(de)活(huo)性(xing)。

 

(2)重組蛋白： 重組蛋白則目標蛋白的豐度較高。重組蛋白主要有三種表達定位：

a、細胞質：在種情況下，必須破壞細胞結構才能得到目的蛋白質，同時伴隨著大量核酸和其它上千種宿主蛋白質的釋放；在zai表biao達da量liang較jiao高gao的de條tiao件jian下xia，一yi般ban形xing成cheng包bao涵han體ti，包bao涵han體ti含han有you過guo表biao達da目mu的de蛋dan白bai，且qie容rong易yi通tong過guo高gao速su離li心xin分fen離li
，但dan是shi包bao涵han體ti的de溶rong解jie與yu複fu性xing是shi較jiao複fu雜za的de。

 

b、外周質： 表達的蛋白質存在於細菌內膜與外膜之間
，這樣目的蛋白可以較少地受到蛋白酶的作用並減少了宿主蛋白的汙染。

 

c
、分泌到培養基：這種表達一般蛋白質濃度較低，主要受到培養基中的汙染。