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（1）一方麵，防止切片從4度直接放入PBS易脫片；
（2）另一方麵，使抗原抗體結合更穩定。一般不需要，但對表達較弱的抗原可能有用，4度和37度時分子運動方式不同，前者分子碰撞機率和運動速度小於後者，後者結合更快，但敏感性也提高了並易造成非特異染色。
（3）其實，我更讚同後一種說法，因為我嚐試把肝髒或睾丸片子從4度過夜拿出後，直接用PBS洗沒發生過脫片現象。
2、切片染色後背景太深，如何區分特異性與非特異性著色？
全片著色是指整個切片全都染上了顏色，著色的強度可深可淺，總之，分不清那些組織是陽性那些組織是陰性。出現這種現象的原因有：
（1）抗體濃度過高：yikangnongduguogaoshichangjiandeyuanyinzhiyi。jiejuebanfashi，meicishiyongxinkangtiqianyingdangduiqigongzuonongdujinxingceshi，shimeiyikangtigetihua，zhaodaoshihezijishiyanshidelixianggongzuonongdu，jishishijiyongxingdekangtiyeyingruci，bunengzhijiandandeanshuomingshujinxingranse。
（2）抗體孵育時間過長或溫度較高：解決辦法是，嚴格執行操作規程，最好隨身佩帶報時表或報時鍾，及時提醒，避免因遺忘而造成時間延長。現在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的時間不是傳統的1小時，而是30分鍾，因此，要根據染色結果進行調整。
（3）DAB變質和顯色時間太長：DAB最好現用現配，如有沉渣應進行過濾後再用。配製好的DAB不應存放時間太長，因為在沒有酶的情況下，過氧化氫也會遊離出氧原子與DAB產生反應而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱裏幾天後再用這種似乎節約的辦法是不可取的。DABdexiansezuihaozaixianweijingxiajiankong，dadaolixiangderansechengdushilijizhongzhifanying。buguodangransepiantaiduoshihuoyongransejishi，zheyangzuosihubuxianshi，danzhishaoyingduiyixiexindehuoshaoyongdekangtixianseshijinxingjiankong，bimianxianseshijianguochang。
（4）組織變幹：修複液溢出後未及時補充液體、染色切片太多、動作太慢、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變幹的原因。解決的辦法是操作要認真仔細，采用DAKO筆或PAP Pen在組織周圍畫圈，可以有效的避免液體流失，也能提高操作速度。
（5）切片在緩衝液或修複液中浸泡時間太長（大於24小時）：yuanyinshangbuqingchu，danxianxiangcunzai。youdeshiyanshixihuanqianyitianjiangqiepiantuolazhixiufu，diertianjiakangtijinxingmianyizuhuaranse，ruguojiangzhuangyouqiepianhexiufuyederongqifangzai4oC冰箱過夜，對結果無明顯影響，如果放在室溫，特別是炎熱的夏天，會出現背景著色，因此，不可存放時間太長。
（6）一抗變質、質量差的多克隆抗體：注意抗體的有效期，過期的抗體要麽不顯色要麽背景著色。用新買的抗體時最好設立陽性對照和用使用過的抗體作比較。
3、脫片產生的原因有哪些？
（1）多duo聚ju賴lai氨an酸suan玻bo片pian質zhi量liang的de問wen題ti。我wo原yuan先xian是shi買mai的de，邁mai新xin按an說shuo也ye是shi不bu錯cuo的de，可ke是shi都dou脫tuo成cheng什shen麼me樣yang子zi了le。後hou麵mian補bu做zuo第di二er批pi時shi用yong的de病bing理li科ke老lao師shi自zi己ji做zuo的de片pian子zi，要yao好hao一yi點dian。
（2）組織切的不好，切片機的問題例如比較老的舊的機器切的厚或者不均勻，或者切片者手法不好等。
（3）沒烤好，時間短，溫度不夠之類。
（4）操作的時候甩的太猛了，有脫片嫌疑的片子最好不甩或輕輕甩，用衛生紙從邊緣上慢慢吸水。
（5）修複的問題：抗原修複的時候高壓時間過長了，或者放進100度的修複液時手法不好，咚的一聲就丟進去了，這樣超容易脫片。此外，用EDTA修複比檸檬酸容易脫片，但是你要用到EDTA的時候也沒辦法，隻有從另外的問題上著手。
（6）一旦見到有組織漂起來操作就更加要謹慎，用PBS的時候盡量用泡的，不要衝。基本上把這些方麵都注意到了，能改善的盡量改善，脫片可以減少很多。
（7）組織的問題，我用的組織癌症的很多，越是癌症組織有壞死之類越容易脫。
4、免疫組化中抗原修複的最佳條件是什麼？（尤其是微波修複）
關於抗原修複，我試過的修複條件有EDTA熱修複，檸檬酸鈉為緩衝液的微波修複以及高壓鍋修複。從我的實驗結果來看，微波修複其實很不容易掉片子的，而EDTA熱(re)修(xiu)複(fu)和(he)高(gao)壓(ya)鍋(guo)修(xiu)複(fu)是(shi)很(hen)容(rong)易(yi)掉(diao)片(pian)子(zi)的(de)。因(yin)為(wei)掉(diao)片(pian)子(zi)主(zhu)要(yao)是(shi)因(yin)為(wei)加(jia)熱(re)過(guo)程(cheng)中(zhong)產(chan)生(sheng)的(de)氣(qi)泡(pao)所(suo)引(yin)起(qi)，而(er)微(wei)波(bo)修(xiu)複(fu)水(shui)加(jia)熱(re)到(dao)沸(fei)騰(teng)，沾(zhan)在(zai)片(pian)子(zi)上(shang)的(de)氣(qi)泡(pao)就(jiu)會(hui)少(shao)，不(bu)會(hui)因(yin)為(wei)小(xiao)氣(qi)泡(pao)上(shang)串(chuan)引(yin)起(qi)脫(tuo)片(pian)。做(zuo)EDTA修xiu複fu時shi，你ni可ke以yi將jiang片pian子zi靠kao的de盡jin量liang近jin些xie，或huo是shi在zai載zai玻bo片pian四si周zhou墊dian些xie棉mian花hua什shen麼me的de，然ran後hou蓋gai上shang蓋gai玻bo片pian，這zhe樣yang修xiu複fu的de話hua就jiu能neng夠gou盡jin量liang減jian少shao載zai玻bo片pian上shang小xiao氣qi泡pao的de形xing成cheng。我wo們men用yong的de微wei波bo修xiu複fu條tiao件jian為wei：2.94g檸檬酸三鈉溶於1000ml的水，調PH值至6.0，微波修複10分鍾。你可以試試，時間可以根據需要自己調整。對於檸檬酸修複來說，隻要高壓修複時間控製在加閥冒氣後90秒，冷水下終止開高壓鍋蓋，高壓修複和微波修複一樣不掉片子，而且一般高壓修複效果往往更好一點；關於EDTA熱修複，一般說明書上都講的是PH值等於9，實際上我試過，如果單傳用EDTA，很容易掉片子，但是用Tris-EDTA,一般就不會掉片子了，Tris-base的濃度為0.05mmol/L,高壓和微波修複都可以，PH也等於9。
5、DAB顯色後發現切片著色不均勻：如一片著色，一片不著色或染色淺？
著色不均勻可能與你的實驗手法有很大關係，可能原因有：
（1）切出的片子厚度本身可能就不一樣，切出一片厚，一片薄，這樣可能造成著色深淺不一。
（2）有you可ke能neng是shi你ni的de顯xian色se液ye底di物wu加jia到dao片pian子zi上shang後hou沒mei有you搖yao勻yun，造zao成cheng局ju部bu底di物wu濃nong度du不bu一yi致zhi，所suo以yi加jia完wan顯xian色se液ye後hou最zui好hao將jiang片pian子zi來lai回hui左zuo右you晃huang動dong幾ji下xia，使shi片pian子zi上shang所suo有you區qu域yu的de底di物wu濃nong度du一yi致zhi。
（3）如ru果guo你ni的de片pian子zi是shi中zhong間jian的de染ran色se深shen，靠kao近jin邊bian上shang的de淺qian，那na有you可ke能neng是shi你ni蠟la圈quan畫hua的de太tai小xiao，顯xian色se液ye覆fu蓋gai的de麵mian積ji不bu過guo大da而er產chan生sheng了le邊bian緣yuan效xiao應ying。最zui外wai側ce的de組zu織zhi片pian最zui好hao離li顯xian色se液ye外wai緣yuan0.5cm。
