將載玻片置於重鉻酸鉀和濃H2SO4混(hun)合(he)液(ye)中(zhong)，目(mu)的(de)是(shi)為(wei)了(le)是(shi)載(zai)玻(bo)片(pian)上(shang)的(de)矽(gui)膠(jiao)等(deng)除(chu)去(qu)，同(tong)時(shi)使(shi)一(yi)些(xie)肉(rou)眼(yan)看(kan)不(bu)見(jian)的(de)凹(ao)凸(tu)不(bu)平(ping)的(de)表(biao)麵(mian)變(bian)平(ping)整(zheng)，便(bian)於(yu)組(zu)織(zhi)吸(xi)附(fu)，然(ran)後(hou)置(zhi)於(yu)清(qing)水(shui)中(zhong)清(qing)洗(xi)
，除(chu)去(qu)殘(can)餘(yu)的(de)重(zhong)鉻(ge)酸(suan)鉀(jia)和(he)濃(nong)H2SO4（大約衝一個小時左右），再將載玻片浸泡於酒精之中
， 然後放到架子上，置於37 oC溫箱中，將多聚賴氨酸塗布於玻片的表麵，由於Lys帶正電
，而大多數的組織帶負電荷

，從而產生吸附作用。

2
、包埋組織

先xian在zai鐵tie模mo具ju中zhong加jia入ru一yi些xie液ye態tai石shi蠟la
，先xian稍shao微wei冷leng卻que，然ran後hou再zai將jiang待dai包bao埋mai的de組zu織zhi置zhi於yu石shi蠟la之zhi中zhong，並bing排pai列lie整zheng齊qi，再zai將jiang塑su料liao模mo具ju盒he蓋gai上shang，最zui後hou加jia入ru少shao許xu液ye體ti石shi蠟la
，進jin行xing冷leng凍dong，使shi石shi蠟la變bian成cheng固gu態tai。

3、切片

將(jiang)包(bao)埋(mai)好(hao)的(de)組(zu)織(zhi)從(cong)模(mo)具(ju)上(shang)取(qu)下(xia)來(lai)
，並(bing)置(zhi)於(yu)石(shi)蠟(la)切(qie)片(pian)機(ji)上(shang)
，切(qie)片(pian)機(ji)通(tong)過(guo)調(tiao)節(jie)上(shang)下(xia)左(zuo)右(you)來(lai)來(lai)使(shi)組(zu)織(zhi)和(he)切(qie)割(ge)方(fang)向(xiang)一(yi)致(zhi)，然(ran)後(hou)調(tiao)節(jie)切(qie)片(pian)的(de)厚(hou)度(du)
，一(yi)般(ban)為(wei)5 um，如果比較難切
，則可以適當調整厚度，用毛筆將切割的載玻片向外拉，並用小鑷子將包含有完整組織的載玻片置於40 oC溫水中。

4、撈組織

當組織載玻片置於40 oCwenshuizhongzhiqian，yaoxianjiangshuiyuzhongdeqipaoganzou
，yimianqipaoshoureshangfuertiedaozuzhishang，zuzhishourezhankai，zuihaoshizuzhibuqizhouwen，yongzaibopianlaozuzhishi，yibanquzaibopiandexia1/3或者下1/2一般每種組織撈5-6張
，其中2-3zhangshibeiyongde，meizhangzaibopianshangtongchanglaoliangfenzuzhi，zuoduizhaoshiyong
，zheyangxingchengdewuchajiubijiaoxiaole
，erqielaozaibopiandeshihouzuihaofangxiangyizhi，yibianguancha
，zaijianglaochulaidezaibopianzhiyujiazishang，fangru37 oC溫箱中烘幹。

5、脫蠟

依次將載玻片放入二甲苯-二甲苯-100%酒精-100%酒精-95%酒精-90%酒精-80%酒精-70%酒精，起脫蠟作用的主要是二甲苯
，依據的是相似相溶的原理。一般在每個試劑中放10 min，天氣熱可以少放幾分鍾
，相反，天氣較冷的話就要適當延長脫蠟時間，一般為12-15 min。

6

、抗原修複

脫蠟後在清水中衝洗一段時間，加入3%H2O2浸泡10 min，從而除去內源性的過氧化氫酶，然後倒掉H2O2
，在清水中洗兩次
，再加入檸檬酸緩衝液，放入微波爐中蒸煮3 min（中火）
，一般剛到沸騰即可，冷卻至室溫
，然後再蒸煮一次

，冷卻至室溫，蒸煮的目的是為了使抗原的位點暴露出來。

7、血清封閉

冷卻至室溫後，將檸檬酸緩衝液倒掉，水洗2次，並將載玻片置於PBS中5 min，洗2次，擦幹組織周圍的PBS液，馬上加上血清，使一些非特異性的位點封閉起來
，然後放入37 oC溫箱中半小時。血清稀釋10倍（900 ul PBS：100 ul血清封閉液）。

8、加一抗

將溫箱中的載玻片取出
，用吸水紙擦幹載玻片反麵和正麵組織周圍的血清，加一抗，如果做對照實驗，就在對照的組織上加PBS。加完一抗後於4oC冰箱中保存過夜。

9、加二抗

將載玻片從冰箱中取出，放入PBS中洗3次，每次5min，擦幹組織周圍的PBS後加上二抗，然後置於37oC溫箱中半小時。

10
、加SABC

將片子從溫箱中取出, 放入PBS中洗3次
，每次5min，擦幹組織周圍的PBS後加上SABC
， 然後置於37oC 溫箱中半小時。SABC稀釋100倍（990ul PBS：10ul SABC）。

11、加顯色劑

將片子從溫箱中取出, 放入PBS中洗3次，每次5min，擦幹組織周圍的PBS後加上顯色劑。（顯色劑的配置：在1ml水中加1滴顯色劑A，搖勻，然後加1滴顯色劑B，搖勻，再加1滴顯色劑C，搖勻）   A：DAB   B：H2O2   C：磷酸緩衝液

12、複染

將顯色後的片子用清水衝洗一段時間後，浸泡於蘇木精中染色，一般動物組織為半分鍾，植物組織3-5min。

13
、脫水

將複染後的片子置於水中衝洗後
，依次將載玻片放入70%酒精-80%酒精-90%酒精-95%酒精-100%酒精-100%酒精-二甲苯-二甲苯。每個試劑中放置2min
，最後浸泡在二甲苯中，搬到通風櫃中。

14、封片

用中性樹膠滴在組織旁邊，再用蓋玻片蓋上，要先放平一側，然後輕輕放下另一側，以免產生氣泡，封好片子後置於通風櫃中晾幹。