一、非特異性染色的主要因素

 

組織的非特異性染色的機理很複雜，其產生的原因主要可分為以下幾點：

 

（1）一部分熒光素未與蛋白質結合

，形成了聚合物和衍化物，而不能被透析除去。

 

（2）抗體以外的血清蛋白與熒光素結合形成熒光素脲蛋白
，可與組織成分結合。

 

（3）除去檢查的抗原以外，組織中還可能存在類屬抗原（如Forssman氏抗原），可與組織中特異性抗原以外之之相應抗體結合。

 

（4）從組織中難於提純抗原性物質，所以製備的免疫血清中往往混雜一些抗其他組織成分的抗體，以致容易混淆。

 

（5）抗體分子上標記的熒光素分子太多，這種過量標記的抗體分子帶過多的陰離子，可吸附於正常組織上而呈現非特異性染色。

 

（6）熒光素不純

，標本固定不當等。

 

二、消除非特異性染色的方法

 

消除熒光抗體非特異性染色的方法應根據產生的原因采取適當的方法，常用的方法有以下幾種：

 

（一）動物髒器粉末吸收法

 

常用肝粉（豬、大白鼠或小白鼠），其次是骨髓粉
、鼠腦粉和雞胚粉等。每毫升熒光抗體中加入肝粉50~100mg
，在離心管中充分混勻，在室溫中振動2h

，4℃中過夜，再攪拌10min
，高速離心（3000~15000r/min）30min，1~2次後

，即可使用其上清液。吸收一般應在臨用前進行，吸收後之熒光抗體保存冰箱中勿超過2周。染色應作吸收前後之比較，吸收時可先用緩衝鹽水將組織幹粉浸濕
，離心（3000~15000r/min）30min

，除去上清液，再加入熒光抗體進行吸收，以免消耗過多的抗體。

 

肝gan粉fen或huo新xin鮮xian細xi胞bao吸xi收shou是shi一yi種zhong非fei特te異yi性xing的de消xiao除chu方fang法fa
，對dui熒ying光guang抗kang體ti的de熒ying光guang色se素su和he蛋dan白bai都dou有you吸xi附fu作zuo用yong。如ru檢jian查zha組zu織zhi中zhong的de病bing毒du抗kang原yuan時shi，也ye可ke用yong相xiang同tong的de組zu織zhi幹gan粉fen或huo勻yun漿jiang沉chen澱dian物wu吸xi收shou之zhi。

 

用髒器肝粉吸收對熒光抗體損失較多，如果根據Hiramotos氏等的方法將組織的20%生理鹽水勻漿液，用生理鹽水洗2~3次
，12000r/min。

 

10minlixinchendian，yongqichendianwuxishouqiyingguangkangtijinengwanquandadaomude，jingjifangjiushirenweizheyangxishouduiyingguangkangtijihumeiyousunshi，tamenchangyongcifa
，xiaoguoshenjia，xishouhoufangzhiyizhouzuoyou
，yongshiyoubiyaozaixishouyici。

 

肝粉的製法：

 

（1）將若幹隻小白鼠或大白鼠放血殺死，取出肝髒，用生理鹽水洗2~3次，除去血液

，剝掉表麵的結締組織的脂肪。

 

（2）剪碎，用生理鹽水反複洗滌至無血色止，然後再加生理鹽水少許
，用組織搗碎機或勻漿器作成勻漿。

 

（3）將肝勻漿裝入離心管內（1/3左右）
，交換地用2~3倍量生理鹽水和丙酮反複洗滌各三次，至上清無血色止，每次完畢先用2000r/min離心沉澱15 min後，再除去上清液。

 

（4）最後用丙酮洗滌肝漿，再用布氏漏鬥過濾，或離心沉澱
，將沉澱物平鋪在潔淨的玻璃板上，37℃烤幹（過夜）。

 

（5）在乳缽中充分研磨，用120目銅篩篩選過後，分裝
，密封，低溫幹燥保存。

 

（二）透析法

 

熒光素如FITC分子可以通過半透膜，而蛋白質大分子不能透過

，可將未與蛋白結合的熒光素透析除去。

 

（1）將標記完畢的熒光蛋白液裝入一透析袋或玻璃紙袋內，液麵稍留空隙，緊紮。

 

（2）浸入0.02mol/pH。

 

7.1~7.4的PBS中（懸於大於標記物體積約50~100倍的PBS內），在4℃中透析，每日更換3~4次PBS，約5~7天
，透析液中無熒即可（在熒光光源照射下）。

 

（三）葡聚糖凝膠G-50柱層析法

 

除遊離熒光素可用2×46cm柱層析法
，詳細方法參閱第二章。加入熒光抗體15~18ml（按床體積的5%~10%加樣），使其緩慢滲入柱內，待即將全部入柱時，加入PBS少許

，關閉下口，停留30~40min ，使shi遊you離li熒ying光guang充chong分fen進jin入ru細xi篩shai孔kong中zhong，然ran後hou再zai接jie通tong洗xi脫tuo瓶ping開kai始shi滴di入ru洗xi脫tuo液ye。加jia入ru洗xi脫tuo液ye一yi定ding量liang後hou，熒ying光guang抗kang體ti即ji向xiang下xia移yi行xing

，逐zhu漸jian與yu存cun留liu於yu上shang端duan的de遊you離li熒ying光guang素su之zhi間jian拉la開kai明ming顯xian的de界jie線xian，隨sui著zhe大da量liang洗xi脫tuo液ye的de不bu斷duan加jia入ru，二er者zhe分fen離li距ju離li越yue來lai越yue大da，熒ying光guang抗kang體ti最zui先xian流liu出chu，分fen前qian

、中、後三部分收集，測F/P比值，合格者合並，濃縮，分裝。洗脫液用20%磺基水楊酸測定蛋白（發生沉澱反應）
，繼續洗脫，遊離熒光素則相繼被洗脫下來

，至洗脫液中無蛋白和熒光素後
，此層析柱即可再用。

 

若用以除去熒光抗體中的遊離熒光素和硫酸銨等鹽類，可先在過柱前透析一夜，否則，太濃NH4+，在蛋白未完全洗脫時即出現NH4+
，因而影響提純與回收蛋白，一般待洗脫液出現蛋白時

，即進行收集，之後出現SO4++（用1%BaCl2檢查發生白色沉澱）。最後是NH4+，（用納氏試劑檢查呈黃棕色沉澱），待洗脫液無SO4++及NH4+後可再用。

 

如僅用小量熒光抗體，可用1×20cm的柱層析柱

，取2g Sephadex G-50裝柱，即可過濾2~3.5ml熒光抗體。

 

（四）DEAE纖維素柱層析法

 

標記過多或過少熒光素的抗體分子可用DEAE-纖維素柱層析法除去。方法如下： DEAE-纖維素柱的裝柱
，洗脫

、再生方法等與提純IgG方法相同。裝柱所需DEAE-纖維素量以幹重每克交換20~50mg標記蛋白量為宜。常用梯度洗脫法如下：

 

（1）層析柱用0.01mol/L、pH7.2PB平衡

，標記物上柱後
，先用0.01mol/L

、pH7.2PB洗脫，洗出無色或淡綠色液體，洗脫液量（根據床體積大小每梯度乘3），然後依下列各種離子強度洗脫液，

 

分別洗脫和收集：

 

0.01mol/L、pH7.2PBS（0.05mol/L NaCl）……洗脫部分1。

 

0.01mol/L、pH7.2PBS（0.01mol/L NaCl）……洗脫部分2。

 

0.01mol/L
、pH7.2PBS（0.02mol/L NaCl）……洗脫部分3。

 

將此三部分收集液（每管5ml）分別測定其F/P比值
，0.05mol/L NaCl pH7.2PB洗脫液280nm光密度高峰管合並，濃縮保存備用。因這部分非特異性染色熒光最少，是比較好的熒光抗體。其他兩部分可以廢棄。

 

（2）柱上吸附的過度標記蛋白可繼續增加NaCl的濃度至2.0mol/L洗脫完。

 

經過DEAE-纖維素層析後的標記抗體，其抗體量一般約損失50%，因此有些要求不太高的抗體，如抗細菌熒光抗體
，不一定要這樣處理，可用染色效價測定的稀釋法除去非特異性染色。

 （五）熒光抗體稀釋法

 

先(xian)測(ce)定(ding)熒(ying)光(guang)抗(kang)體(ti)特(te)異(yi)性(xing)染(ran)色(se)與(yu)非(fei)特(te)異(yi)性(xing)染(ran)色(se)的(de)效(xiao)價(jia)，若(ruo)二(er)者(zhe)效(xiao)價(jia)相(xiang)差(cha)較(jiao)大(da)，則(ze)可(ke)將(jiang)熒(ying)光(guang)抗(kang)體(ti)稀(xi)釋(shi)至(zhi)一(yi)臨(lin)界(jie)濃(nong)度(du)
，使(shi)特(te)異(yi)性(xing)染(ran)色(se)呈(cheng)陽(yang)性(xing)
，而(er)使(shi)非(fei)特(te)異(yi)性(xing)染(ran)色(se)保(bao)持(chi)陰(yin)性(xing)，稀(xi)釋(shi)方(fang)法(fa)和(he)染(ran)色(se)效(xiao)價(jia)測(ce)定(ding)方(fang)法(fa)相(xiang)同(tong)。

 

（六）純化抗原法

 

用各種方法提純單一成分的抗原是產生單價特異性抗體的最主要條件。近代免疫化學技術（免疫吸收法）和柱層析法等提供了很大的可能性，可參考有關專著。

 

（七）純化抗體法——免疫吸收法

 

例如抗IgA血清的純化方法---免疫吸收法。如分泌型IgA（SIgA）抗原純度不高，所製的抗血清常與IgG呈交叉反應，為此需要吸收，常采用純化的人IgG戊二醛聚合物加以吸收純化。方法如下：

 

1、人IgG聚合物的製備    在5ml含40mg/ml人IgG的0.1mol/L pH7.0磷酸緩衝溶液中，加入2.5%戊二醛溶液1ml，邊加邊攪，5min即出現混濁，逐現大塊膠塊
，放置30min後
，用研缽將凝膠磨細

，繼用 1.0mol/L pH7.0磷酸緩衝溶液反複洗滌3次，末次加蒸餾水至20ml，即為人IgG聚合物懸液。

 

2、免疫吸收法    將待吸收的抗SIgG血清加入待量IgG聚合物懸液，置室溫攪拌60min，離心沉澱
，上清液即稀釋1倍的純化抗SIgA血清。如用IgG聚合物作少量分次吸收
，其效果更好。

 

（八）伊文氏藍（Evans blue）襯染法

 

用0.01%伊文氏藍的0.01mol/L pH7.2PBS稀(xi)釋(shi)熒(ying)光(guang)抗(kang)體(ti)，可(ke)將(jiang)背(bei)景(jing)細(xi)胞(bao)和(he)組(zu)織(zhi)染(ran)色(se)，呈(cheng)紅(hong)色(se)熒(ying)光(guang)
，與(yu)特(te)異(yi)性(xing)黃(huang)綠(lv)色(se)熒(ying)光(guang)形(xing)成(cheng)鮮(xian)明(ming)的(de)對(dui)比(bi)
，減(jian)少(shao)了(le)非(fei)特(te)異(yi)性(xing)熒(ying)光(guang)，宜(yi)作(zuo)常(chang)規(gui)應(ying)用(yong)。伊(yi)文(wen)氏(shi)藍(lan)一(yi) 般先配成1%溶液
，保存於4℃
，用前再稀釋至0.01%用以稀釋熒光抗體。

 

此外
，還可以用胰酶消化組織切片或用10%牛血清蛋白封閉法等消除非特異性染色，提高特異性染色。

 

參考文獻

 

1.Coons AH,et al. Localization of antigen in tissue cell. II. Improvements in a method for the detection of antigen by means of fluorescent an-tibody. J Exp Med,1950;91:1-3.

 

2.Riggs JL, Seiwald RI, Burckhulter J, Powns CM and Metcalf TG. Iosthiocyanate compounds as fluorescent labeling agents for immune serum. Am J Path, 1958; 34:1081~1097.

 

3.Marshall ID Jr, Eveland WC and Smith CW. Superiority of fluorescein isothiocyanate (Riggs)for fluorescent antibody technique with a modi-ification of its application. Proc sec Exper Biol C Med(NP), 1958;98:898~900.

 

4.Goldstein G, Slizys IS and Chase MW. Stuides on fluoresent staining.1. Nonspecific fluorescence with fluorescein - coupled sheep anti-rab-bit globulins. J Exper Med, 1961;114:89~110.

 

5.Nairn RC. Fluorecent protein tracing. E & S Living stone LTD. Edinburgh and . London, Third Edition, 1969136~142, PP152~264.

 

6.王伯沄，免疫熒光組織化學和熒光組織化學技術
，第四軍醫大學科技資料增刊，1974；2：5~30。

 

7. Huang SN, et al. Application of immunofluorescent staining on paraffin section improved by trypsin digestion . Lab Invest, 1976; 35:383.

 

8.Gotako Yamad, et al .Hepatitis B core and surface antigens in liver tissue. Lab Invest, 1977;36:649.

 

9.黃 策，免疫熒光和熒光免疫，1983年，全軍三防醫學會議報告論文。

 

10. 張忠兵，等。雙標記免疫熒光法對胃粘膜抗體產生細胞的對比研究。上海免疫學雜誌
，1983；3（5）：304。

 

11.Fairbanks TR. Current status of lymphocyte subpopulation testing in humans. Am J Med Technol, 1980;46:471.

 

12.李元敏等譯
，免疫細胞化學。原子能出版社，1985：25~44。

 

13.Wick G,Traill KN, Schouestein K. Immunofluorescence Technology， Selected Theoretical and Clinical Aspects. Elseries Biomedical Press. Amsterdom, 198227~36, P181, P219~262, P317~323.

 

14. AKiyoshi Kawamura Jr. Fluorescent antibody . Technique and Their Applications. Second Edition University of Tokyo Press， Tokyo,197710,P79,P141~281.

 

15. Ray MB, et al. Immunofluorescent detection of alphaantitrypsin in paraffin embed allowfullscreen='true'ded liver. J Clin Pathol, 1975;28:717.

 

16. 王伯沄，胰酶消化法提高甲醛固定石蠟切片免疫組織化學法敏感性方法，第四軍醫大學學報，1982；2：127。

 

17. Aurel F. Labelled antibodies in biology and medicine. Printed in Romania,1978P52-190.

 

18. 王伯沄，免疫熒光技術：汪美先主編。免疫學基礎。西安：陝西省科學技術出版社，1981：279-295。

 

19. 59175部隊。熒光顯微術。上海科學技術情報所

，1976：224~288。

 

20. Polak JM and Noorden SV. Immunocytochemistry, PP233~248 Wright, PSG. 1983.

 

21. 李成文。現代免疫化學技術。上海：上海科技出版社，1992：97~100。