一(yi)般(ban)來(lai)說(shuo)，如(ru)果(guo)用(yong)多(duo)聚(ju)賴(lai)氨(an)酸(suan)包(bao)被(bei)過(guo)的(de)片(pian)子(zi)做(zuo)正(zheng)常(chang)免(mian)疫(yi)組(zu)織(zhi)化(hua)學(xue)染(ran)色(se)的(de)話(hua)是(shi)不(bu)會(hui)掉(diao)片(pian)子(zi)的(de)。但(dan)如(ru)果(guo)要(yao)做(zuo)抗(kang)原(yuan)修(xiu)複(fu)的(de)話(hua)，如(ru)果(guo)片(pian)子(zi)處(chu)理(li)不(bu)好(hao)的(de)話(hua)是(shi)有(you)可(ke)能(neng)掉(diao)片(pian)子(zi)的(de)。你(ni)可(ke)以(yi)試(shi)試(shi)一(yi)下(xia)的(de)方(fang)法(fa)：

1.一般用APES：丙酮=1:50的處理液來處理片子
，處理5min左右

，然後水洗
，烘幹既可用於貼片。如果把水滴再處理好的片子上
，水比較聚的話說明片子處理的好。

2.貼片子的時候，展片的時間要把握好，不要太長，否則不利於貼牢。

3.烤片子也很重要，切好的片子最好先不要馬上收起來，而是水平至於烘片台上37度兩個小時以上，一是水分徹底烘幹。然後做染色前最好再在60度烘箱烘1個小時。

4.再補充一點
，石蠟包埋時
，酒精梯度脫水以及浸蠟等一點要充分，這對貼片也有影響。

如果這些導致掉片的因素都已經排除但是片子還是掉的厲害

，那麼也可能是以下原因造成的：

1、多(duo)聚(ju)賴(lai)氨(an)酸(suan)玻(bo)片(pian)質(zhi)量(liang)的(de)問(wen)題(ti)。我(wo)原(yuan)先(xian)是(shi)買(mai)的(de)，邁(mai)新(xin)按(an)說(shuo)也(ye)是(shi)不(bu)錯(cuo)的(de)，可(ke)是(shi)都(dou)脫(tuo)成(cheng)什(shen)麼(me)樣(yang)子(zi)了(le)。後(hou)麵(mian)補(bu)做(zuo)第(di)二(er)批(pi)時(shi)用(yong)的(de)病(bing)理(li)科(ke)老(lao)師(shi)自(zi)己(ji)做(zuo)的(de)片(pian)子(zi)，要(yao)好(hao)一(yi)點(dian)。

2
、組織切的不好，切片機的問題例如比較老的舊的機器切的厚或者不均勻，或者切片者手法不好等。

3、組織的問題，我用的組織癌症的很多，越是癌症組織有壞死之類越容易脫。

4、沒烤好，時間短溫度不夠之類。

5、操作的時候甩的太猛了，有脫片嫌疑的片子最好不甩或輕輕甩，用衛生紙從邊緣上慢慢吸水。

6、修複的問題：抗原修複的時候高壓時間過長了
，或者放進100度的修複液時手法不好，咚的一聲就丟進去了，這樣超容易脫片。此外
，用EDTA修複比檸檬酸容易脫片，但是你要用到EDTA的時候也沒辦法

，隻有從另外的問題上著手。

       此外
，一旦見到有組織漂起來操作就更加要謹慎，用PBS的時候盡量用泡的，不要衝。基本上把這些方麵都注意到了
，能改善的盡量改善
，脫片可以減少很多。

二. DAB顯色後發現切片著色不均勻：如一片著色
，一片不著色或染色淺？

       著色不均勻可能與你的實驗手法有很大關係
，可能原因有：

1.切出的片子厚度本身可能就不一樣
，切出一片厚，一片薄，這樣可能造成著色深淺不一。

2.有可能是你 顯xian色se液ye底di物wu加jia到dao片pian子zi上shang後hou沒mei有you搖yao勻yun
，造zao成cheng局ju部bu底di物wu濃nong度du不bu一yi致zhi，所suo以yi加jia完wan顯xian色se液ye後hou最zui好hao將jiang片pian子zi來lai回hui左zuo右you晃huang動dong幾ji下xia，使shi片pian子zi上shang所suo有you區qu域yu的de底di物wu濃nong度du一yi致zhi。

3.如(ru)果(guo)你(ni)的(de)片(pian)子(zi)是(shi)中(zhong)間(jian)的(de)染(ran)色(se)深(shen)，靠(kao)近(jin)邊(bian)上(shang)的(de)淺(qian)，那(na)有(you)可(ke)能(neng)是(shi)你(ni)蠟(la)圈(quan)畫(hua)的(de)太(tai)小(xiao)

，顯(xian)色(se)液(ye)覆(fu)蓋(gai)的(de)麵(mian)積(ji)不(bu)過(guo)大(da)而(er)產(chan)生(sheng)了(le)邊(bian)緣(yuan)效(xiao)應(ying)。最(zui)外(wai)側(ce)的(de)組(zu)織(zhi)片(pian)最(zui)好(hao)離(li)顯(xian)色(se)液(ye)外(wai)緣(yuan)0.5cm。

三. 切片染色後背景太深
，不易區分特異性與非特異性著色？

a.也許是抗體本身有問題，因為有很多公司的抗體質量並不好，很容易上背景，可以換一種抗體 試試。

b.如果經費不允許換抗體的話，你可降低抗體的濃度，並隨時注意觀察顯色
，在能看到信號的情況下盡量降低背景。

c.可以換一種封閉液，不同的封閉液對某種來源的抗體來說
，會有不同的封閉效果。

d.可以在一抗和二抗中加入一定比例的你所檢測動物組織的正常血清，這樣可以去除一部分非特異性染色。

全片著色

       全片著色是指整個切片全都染上了顏色
，著色的強度可深可淺，總之
，分不清那些組織是陽性那些組織是陰性。出現這種現象的原因有：

（1）抗體濃度過高：一yi抗kang濃nong度du過guo高gao是shi常chang見jian的de原yuan因yin之zhi一yi。解jie決jue辦ban法fa是shi，每mei次ci使shi用yong新xin抗kang體ti前qian應ying當dang對dui其qi工gong作zuo濃nong度du進jin行xing測ce試shi，使shi每mei一yi抗kang體ti個ge體ti化hua
，找zhao到dao適shi合he自zi己ji實shi驗yan室shi的de理li想xiang工gong作zuo濃nong度du，既ji使shi是shi即ji用yong型xing的de抗kang體ti也ye應ying如ru此ci
，不bu能neng隻zhi簡jian單dan的de按an說shuo明ming書shu進jin行xing染ran色se。

（2）抗體孵育時間過長或溫度較高：解決辦法是，嚴格執行操作規程
，最好隨身佩帶報時表或報時鍾，及時提醒，避免因遺忘而造成時間延長。現在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的時間不是傳統的1小時，而是30分鍾
，因此
，要根據染色結果進行調整。

（3）DAB變質和顯色時間太長：DAB最好現用現配

，如有沉渣應進行過濾後再用。配製好的DAB不應存放時間太長

，因為在沒有酶的情況下，過氧化氫也會 遊離出 氧原子與DAB產生反應而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱裏幾天後再用這種似乎節約的辦法是不可取的。DAB的顯色最好在顯微鏡下監控，達到 理(li)想(xiang)的(de)染(ran)色(se)程(cheng)度(du)時(shi)立(li)即(ji)終(zhong)止(zhi)反(fan)應(ying)。不(bu)過(guo)當(dang)染(ran)色(se)片(pian)太(tai)多(duo)時(shi)或(huo)用(yong)染(ran)色(se)機(ji)時(shi)，這(zhe)樣(yang)做(zuo)似(si)乎(hu)不(bu)現(xian)實(shi)，但(dan)至(zhi)少(shao)應(ying)對(dui)一(yi)些(xie)新(xin)的(de)或(huo)少(shao)用(yong)的(de)抗(kang)體(ti)顯(xian)色(se)時(shi)進(jin)行(xing)監(jian)控(kong)
，避(bi)免(mian)顯(xian)色(se)時(shi)間(jian)過(guo)長(chang)。

（4）組織變幹：修複液溢出後未及時補充液體、染色切片太多
、動作太慢、忘記滴液

、滴液流失等都是造成組織變幹的原因。解決的辦法是操作要認真仔細
，采用DAKO筆或PAP Pen在組織周圍畫圈，可以有效的避免液體流失

，也能提高操作速度。

（5）切片在緩衝液或修複液中浸泡時間太長（大於24小時）：原因上不清楚
，但現象存在。有的實驗室喜歡前一天將切片脫蠟至修複，第二天加抗體進行免疫組 化染 色
，如果將裝有切片和修複液的容器放在4?C冰箱過夜
，對結果無明顯影響，如果放在室溫，特別是炎熱的夏天，會出現背景著色
，因此，不可存放時間太 長。

（6）一抗變質
、質量差的多克隆抗體：注意抗體的有效期，過期的抗體要麽不顯色要麽背景著色。用新買的抗體時最好設立陽性對照和用使用過的抗體作比較。

四. 免疫組化結果老是出現陰性結果？

      mianyizuhuachuxianyinxingjieguoyoukenengzuzhibenshenjiumeiyouxinhao
，yeyoukenengshikangtichulewenti。keyizhaoyixieyangxingzuzhizuoyixia
，yiquedingshikangtidewentihaishizuzhibenshenjiumeiyousuojiancedekangyuanbiaoda。haiyou，keyitigaokangtidenongdu，huozheshiyishikangyuanxiufudengfangfa，yexuhuidedaoyixiangbudaodejieguo。

五. 一抗從4度拿出後，為什麼有人說要37度複溫，目的是什麼？

1. 一方麵
，防止切片從4度直接放入PBS易脫片；

2. 另一方麵，使抗原抗體結合更穩定。一般不需要,但對表達較弱的抗原可能有用,4度和37度時分子運動方式不同,前者分子碰撞機率和運動速度小於後者,後者結合更快,但敏感性也提高了並易造成非特異染色。

六. 免疫組化中抗原修複的最佳條件是什麼？尤其是微波修複。

       關於抗原修複
，我個人的觀點和panther75有點不同。我試過的修複條件有EDTA熱修複，檸檬酸鈉為緩衝液的微波修複以及高壓鍋修複。從我的實驗結果 來看，微波修複其實很不容易掉片子的

，而EDTA熱修複和高壓鍋修複是很容易掉片子的。因為掉片子主要是因為加熱過程中產生的氣泡所引起

，而微波修複水加 熱到沸騰，沾在片子上的氣泡就會少
，不會因為小氣泡上串引起脫片。做EDTA修複時，你可以將片子靠的盡量近些，或是在載玻片四周墊些棉花什麼的
，然後蓋 上蓋玻片，這樣修複的話就能夠盡量減少載玻片上小氣泡的形成。

       我們用的微波修複條件為：

       2.94g檸檬酸三鈉溶於1000ml的水，調ph值至6.0
，微波修複10分鍾。你可以試試，時間可以根據需要自己調整。

七. 有人在一抗孵育前用tritonX100來通透細胞，對石蠟切片需要否
？

       用yong石shi蠟la切qie片pian做zuo免mian疫yi組zu化hua是shi不bu需xu要yao透tou膜mo處chu理li的de，一yi是shi因yin為wei石shi蠟la切qie片pian比bi較jiao薄bo
，另ling外wai一yi個ge原yuan因yin我wo認ren為wei是shi在zai包bao埋mai過guo程cheng中zhong細xi胞bao膜mo已yi經jing被bei破po壞huai

，所suo以yi這zhe一yi步bu可ke以yi省sheng略lve。

八. 蘇木素複染的時間應該是多少？複染過度咋辦？

       複染時間不需要太長
，當然這也要根據蘇木精的質量來確定，但基本上不要超多一分鍾。染色過深的話可以用酸性的水溶液（在水裏滴加少量濃鹽酸）分色，分色的另 waiyigemudeshixidiaosumujingzaixibaozhizhongdefeiteyixingjiehe，zheyangkeyishixibaozhizhongdeteyixinhaogengmingxian。suoyibuguanfuranshibushiguodu，fensezheyibuzuihaobuyaoshengdiao。fensehoujidezai 用氨水返藍一下。