一、無色片

 

      染色結束後，切片中見不到任何陽性信號。這是常規工作中比較常見的現象，出現這種現象，有兩種可能：1、真陰性結果：整個染色過程沒有出現問題，組織或細胞確實不表達與抗體相關的抗原。2
、假陰性結果：即此陰性結果不是真實的反映。假陰性結果又可分為兩種情況：（1）切(qie)片(pian)中(zhong)根(gen)本(ben)就(jiu)不(bu)包(bao)含(han)所(suo)預(yu)期(qi)檢(jian)查(zha)的(de)組(zu)織(zhi)或(huo)細(xi)胞(bao)。出(chu)現(xian)這(zhe)種(zhong)情(qing)況(kuang)，要(yao)麽(me)是(shi)病(bing)理(li)醫(yi)生(sheng)選(xuan)擇(ze)錯(cuo)了(le)切(qie)片(pian)或(huo)抗(kang)體(ti)選(xuan)錯(cuo)了(le)
，要(yao)麽(me)是(shi)技(ji)術(shu)員(yuan)選(xuan)錯(cuo)了(le)蠟(la)塊(kuai)。獲(huo)得(de)正(zheng)確(que)的(de)切(qie)片(pian)進(jin)行(xing)染(ran)色(se)是(shi)獲(huo)得(de)正(zheng)確(que)結(jie)果(guo)的(de)前(qian)提(ti)。由(you)此(ci)表(biao)明(ming)：製作出合格的免疫組化切片不僅僅是技術員的事
，病理醫生也起著不可缺少的作用。（2）染色過程中的某一或某些環節出了問題。比如，組織未進行抗原修複
，有的組織必須經過抗原修複才能檢測抗原表達；或選用了隻能用於冰凍組織而不能用於石蠟包埋組織的抗體；或一抗失效
，雖然抗體失效在理論上是一個逐漸的過，但偶爾也遇到突然失效的情況，抗體長期不用和/或已超過有效期是主要的原因。也可見於染色過程中漏掉了某一環節
，如忘記加二抗或三抗

，或用了兩次二抗而缺少了三抗，或配製DAB時少了過氧化氫。為了避免這種簡單的錯誤，有一種簡單的方法：在三抗孵育結束時，將切片上的三抗甩在一張白紙上，在將配製好的DAB滴一滴在白紙的三抗上，觀察是否出現棕色。如果出現了
，證明三抗和DAB的配製過程沒有錯誤。如果這種DAB再滴到切片上沒有出現任何陽性信號，問題一定是出在三抗以前。如果紙上不出現棕色反應，問題肯定在三抗或DAB的配製過程。這種簡單方法能迅速的幫助我們查找出現問題可能的原因。

 

      解決陰性染色的問題非常簡單
，就是設立“陽性對照”。如(ru)果(guo)陽(yang)性(xing)對(dui)照(zhao)有(you)了(le)表(biao)達(da)
，說(shuo)明(ming)染(ran)色(se)的(de)全(quan)過(guo)程(cheng)和(he)所(suo)有(you)試(shi)劑(ji)都(dou)沒(mei)有(you)問(wen)題(ti)。如(ru)果(guo)此(ci)時(shi)測(ce)試(shi)片(pian)仍(reng)為(wei)陰(yin)性(xing)
，便(bian)是(shi)真(zhen)實(shi)的(de)陰(yin)性(xing)，說(shuo)明(ming)組(zu)織(zhi)或(huo)細(xi)胞(bao)沒(mei)有(you)相(xiang)應(ying)的(de)抗(kang)原(yuan)表(biao)達(da)。反(fan)之(zhi)，如(ru)果(guo)陽(yang)性(xing)對(dui)照(zhao)沒(mei)有(you)著(zhe)色(se)
，表(biao)明(ming)染(ran)色(se)過(guo)程(cheng)中(zhong)某(mou)個(ge)或(huo)某(mou)些(xie)步(bu)驟(zhou)出(chu)了(le)問(wen)題(ti)或(huo)試(shi)劑(ji)出(chu)了(le)問(wen)題(ti)。應(ying)一(yi)一(yi)尋(xun)找(zhao)原(yuan)因(yin)。陽(yang)性(xing)對(dui)照(zhao)包(bao)括(kuo)兩(liang)種(zhong)，一(yi)種(zhong)稱(cheng)為(wei)“自身對照”或“內部對照”

，這是指在測試的切片中本身就存在已知的抗原，如正常淋巴結中存在T和B細胞抗原，CD20或CD3都dou應ying該gai有you表biao達da。自zi身shen對dui照zhao是shi一yi種zhong比bi較jiao理li想xiang的de對dui照zhao，對dui照zhao和he測ce試shi組zu織zhi或huo細xi胞bao都dou在zai同tong一yi張zhang切qie片pian中zhong

，都dou處chu於yu相xiang同tong的de試shi驗yan條tiao件jian下xia，結jie果guo更geng可ke靠kao也ye更geng具ju有you可ke比bi性xing。在zai選xuan擇ze自zi身shen對dui照zhao片pian時shi最zui好hao選xuan擇ze既ji有you病bing變bian組zu織zhi同tong時shi又you有you正zheng常chang組zu織zhi的de部bu分fen，這zhe樣yang有you利li於yu對dui比bi。另ling一yi種zhong稱cheng為wei“外部對照”，有時在測試的切片中不存在已知的抗原，如在胃的標本中懷疑是惡性黑色素瘤


，需要用HMB45或Mart-1laijiance，zaizhengchangdeweizuzhizhongbenshenbucunzaixiangguandekangyuan，ruguobingbianchuxianyangxingfanyingjieguo
，shangnengtishishiehei
，danshiruguochuxianyinxingjieguo，jiuwufaquedingshibenshenzuzhizhongbuhanheisesuliukangyuan，haishijishuwenti。yinci，yinglingwaisheliyigeyizhideyangxingduizhao。zhezhongzaiceshizuzhizhiwaideyangxingduizhaochengwei“外部對照”。在zai實shi際ji工gong作zuo中zhong需xu要yao設she立li外wai部bu對dui照zhao的de情qing況kuang很hen多duo，如ru果guo每mei一yi種zhong抗kang體ti都dou要yao選xuan不bu同tong的de陽yang性xing對dui照zhao
，工gong作zuo量liang會hui很hen大da。為wei了le解jie決jue這zhe個ge問wen題ti，目mu前qian國guo內nei外wai有you單dan位wei將jiang多duo種zhong不bu同tong組zu織zhi集ji成cheng在zai一yi起qi
，製zhi成cheng多duo組zu織zhi切qie片pian、“臘腸”“春卷”切片、zuzhixinpiandeng，qilianxuqiepianchubeidaiyong，xuyaoshiquchuyizhangbiankezuoweiyangxingduizhao。lingwai，bijiaojiandandefangfa，shicaiyonglanweizuoweiyangxingduizhao，yinweiyurentiqitazuzhiqiguanbijiaolanweibaohandezuzhizhongleijiaoduo
，ruyoushangpi
、淋巴組織
、平滑肌
、間質
、神經、血管、間皮等。一張闌尾切片可以檢測大多數常用的抗體。

 

      設立陽性對照是病理醫生的任務或責任，而不是技術員的責任。病理醫生觀察了HE切(qie)片(pian)

，了(le)解(jie)切(qie)片(pian)中(zhong)是(shi)否(fou)有(you)自(zi)身(shen)對(dui)照(zhao)
，如(ru)果(guo)沒(mei)有(you)，就(jiu)應(ying)告(gao)訴(su)技(ji)術(shu)員(yuan)采(cai)用(yong)陽(yang)性(xing)對(dui)照(zhao)。因(yin)此(ci)，病(bing)理(li)醫(yi)生(sheng)在(zai)免(mian)疫(yi)組(zu)化(hua)中(zhong)的(de)作(zuo)用(yong)是(shi)不(bu)可(ke)忽(hu)視(shi)的(de)。抗(kang)體(ti)未(wei)覆(fu)蓋(gai)上(shang)測(ce)試(shi)組(zu)織(zhi)：當多塊散開的小組織染色時，可能漏掉某塊組織染色。

 

二、“雜音”染色片

 

      免疫組化除正常的真實的陽性信號外常常會遇到不正常的背景著色，這些非正常的著色稱為“雜音”染色。“雜音”染色種類繁多，產生的原因也多種多樣
，為了便於說明
，筆者將其歸納為下麵幾種。

 

1、全片著色

 

      全片著色是指整個切片全都染上了顏色
，著色的強度可深可淺
，總之，分不清那些組織是陽性那些組織是陰性。出現這種現象的原因有：

 

      （1）抗體濃度過高：一(yi)抗(kang)濃(nong)度(du)過(guo)高(gao)是(shi)常(chang)見(jian)的(de)原(yuan)因(yin)之(zhi)一(yi)。解(jie)決(jue)辦(ban)法(fa)是(shi)，每(mei)次(ci)使(shi)用(yong)新(xin)抗(kang)體(ti)前(qian)應(ying)當(dang)對(dui)其(qi)工(gong)作(zuo)濃(nong)度(du)進(jin)行(xing)測(ce)試(shi)，使(shi)每(mei)一(yi)抗(kang)體(ti)個(ge)體(ti)化(hua)，找(zhao)到(dao)適(shi)合(he)自(zi)己(ji)實(shi)驗(yan)室(shi)的(de)理(li)想(xiang)工(gong)作(zuo)濃(nong)度(du)
，既(ji)使(shi)是(shi)即(ji)用(yong)型(xing)的(de)抗(kang)體(ti)也(ye)應(ying)如(ru)此(ci)，不(bu)能(neng)隻(zhi)簡(jian)單(dan)的(de)按(an)說(shuo)明(ming)書(shu)進(jin)行(xing)染(ran)色(se)。

 

      （2）抗體孵育時間過長或溫度較高：解決辦法是，嚴格執行操作規程，最好隨身佩帶報時表或報時鍾
，及時提醒，避免因遺忘而造成時間延長。現在流行的二步法（Polymer）敏感性很高，要求一抗孵育的時間不是傳統的1小時
，而是30分鍾，因此，要根據染色結果進行調整。

 

      （3）DAB變質和顯色時間太長：DAB最好現用現配
，如有沉渣應進行過濾後再用。配製好的DAB不應存放時間太長
，因為在沒有酶的情況下，過氧化氫也會遊離出氧原子與DAB產生反應而降低DAB的效力，未用完的DAB存放在冰箱裏幾天後再用這種似乎節約的辦法是不可取的。DABdexiansezuihaozaixianweijingxiajiankong，dadaolixiangderansechengdushilijizhongzhifanying。buguodangransepiantaiduoshihuoyongransejishi
，zheyangzuosihubuxianshi
，danzhishaoyingduiyixiexindehuoshaoyongdekangtixianseshijinxingjiankong
，bimianxianseshijianguochang。

 

      （4）組織變幹：修複液溢出後未及時補充液體、染色切片太多、動作太慢
、忘記滴液、滴液流失等都是造成組織變幹的原因。解決的辦法是操作要認真仔細
，采用DAKO筆或PAPPen在組織周圍畫圈
，可以有效的避免液體流失，也能提高操作速度。

 

      （5）切片在緩衝液或修複液中浸泡時間太長（大於24小時）：原(yuan)因(yin)上(shang)不(bu)清(qing)楚(chu)，但(dan)現(xian)象(xiang)存(cun)在(zai)。有(you)的(de)實(shi)驗(yan)室(shi)喜(xi)歡(huan)前(qian)一(yi)天(tian)將(jiang)切(qie)片(pian)脫(tuo)蠟(la)至(zhi)修(xiu)複(fu)，第(di)二(er)天(tian)加(jia)抗(kang)體(ti)進(jin)行(xing)免(mian)疫(yi)組(zu)化(hua)染(ran)色(se)，如(ru)果(guo)將(jiang)裝(zhuang)有(you)切(qie)片(pian)和(he)修(xiu)複(fu)液(ye)的(de)容(rong)器(qi)放(fang)在(zai)4度冰箱過夜，對結果無明顯影響，如果放在室溫
，特別是炎熱的夏天，會出現背景著色
，因此
，不可存放時間太長。

 

      （6）一抗變質、質量差的多克隆抗體：注意抗體的有效期，過期的抗體要麽不顯色要麽背景著色。用新買的抗體時最好設立陽性對照和用使用過的抗體作比較。

2、切片邊緣著色

 

      切片邊緣著色也是一種常見的現象，這種現象稱為邊緣效應。產生的原因：（1）組織邊緣與玻片粘貼不牢，邊緣組織鬆脫漂浮在液體，每次清洗不易將組織下麵試劑洗盡所致。解決辦法：製備優質的膠片（APES或多聚賴氨酸），切出盡量薄的組織切片
，不厚於4微米，組織的前期處理應規範，盡量避免選用壞死較多的組織。（2）切片上滴加的試劑未充分覆蓋組織，邊緣的試劑容易首先變幹，濃度較中心組織高而致染色深。解決辦法：試劑要充分覆蓋組織，應超出組織邊緣2mm。用DAKO筆畫圈時，為了避免油劑的影響
，畫圈應距組織邊緣3-4mm。

 

3、“陰陽臉”著色

 

      指(zhi)組(zu)織(zhi)一(yi)半(ban)著(zhe)色(se)一(yi)半(ban)無(wu)著(zhe)色(se)，形(xing)成(cheng)交(jiao)界(jie)清(qing)晰(xi)或(huo)不(bu)甚(shen)清(qing)晰(xi)的(de)兩(liang)種(zhong)染(ran)色(se)結(jie)果(guo)。其(qi)成(cheng)因(yin)是(shi)試(shi)劑(ji)僅(jin)覆(fu)蓋(gai)了(le)部(bu)分(fen)組(zu)織(zhi)而(er)不(bu)是(shi)全(quan)部(bu)。如(ru)加(jia)試(shi)劑(ji)後(hou)未(wei)讓(rang)試(shi)劑(ji)流(liu)散(san)開(kai)而(er)集(ji)中(zhong)在(zai)部(bu)分(fen)組(zu)織(zhi)上(shang)。通(tong)常(chang)應(ying)該(gai)在(zai)加(jia)完(wan)試(shi)劑(ji)後(hou)，仔(zai)細(xi)看(kan)一(yi)遍(bian)
，是(shi)否(fou)有(you)的(de)組(zu)織(zhi)未(wei)被(bei)試(shi)劑(ji)完(wan)全(quan)覆(fu)蓋(gai)
，如(ru)有(you)這(zhe)種(zhong)情(qing)況(kuang)，建(jian)議(yi)用(yong)牙(ya)簽(qian)而(er)不(bu)是(shi)用(yong)吸(xi)頭(tou)或(huo)試(shi)劑(ji)瓶(ping)口(kou)將(jiang)試(shi)劑(ji)引(yin)流(liu)開(kai)使(shi)之(zhi)將(jiang)組(zu)織(zhi)全(quan)部(bu)覆(fu)蓋(gai)。另(ling)外(wai)
，染(ran)片(pian)盒(he)不(bu)平(ping)，切(qie)片(pian)傾(qing)斜(xie)，雖(sui)然(ran)開(kai)始(shi)試(shi)劑(ji)已(yi)全(quan)部(bu)覆(fu)蓋(gai)了(le)組(zu)織(zhi)，但(dan)後(hou)來(lai)試(shi)劑(ji)流(liu)向(xiang)一(yi)邊(bian)，部(bu)分(fen)組(zu)織(zhi)未(wei)被(bei)試(shi)劑(ji)覆(fu)蓋(gai)。對(dui)於(yu)這(zhe)種(zhong)問(wen)題(ti)，隻(zhi)要(yao)留(liu)心(xin)或(huo)想(xiang)到(dao)了(le)很(hen)容(rong)易(yi)發(fa)現(xian)
，也(ye)很(hen)容(rong)易(yi)解(jie)決(jue)。有(you)時(shi)，用(yong)DAKO（或PAP）bizaizuzhizhouweihuaquanshi
，huaxiantaikaojinhuohuadaolezuzhishang，youyubiyoudelixueyuanli
，shijibunengdadaokaojinhuaxianfujindezuzhi。haiyouqipaoyekeyinqiyinyangfenmingdezhese，zhishibuzhesequyushiyuanxing，youyuqipaozhonghanqi，shijibeituidaozhouwei，yinci
，qipaozhongxindezuzhibuzhese。jiejuebanfashidijiashijishishoufayaoqing
，youqipaoshiyongyaqiantongpo。

 

4、灶片狀著色

 

      切片中著色區東一塊西一塊，呈灶片狀分布，出現這種問題的原因有：（1）裱(biao)片(pian)時(shi)水(shui)未(wei)排(pai)盡(jin)

，在(zai)局(ju)部(bu)形(xing)成(cheng)氣(qi)泡(pao)使(shi)組(zu)織(zhi)突(tu)起(qi)，染(ran)色(se)時(shi)試(shi)劑(ji)滲(shen)入(ru)後(hou)不(bu)易(yi)洗(xi)盡(jin)，顯(xian)色(se)過(guo)深(shen)所(suo)致(zhi)。解(jie)決(jue)辦(ban)法(fa)是(shi)

，漂(piao)片(pian)盒(he)裏(li)的(de)氣(qi)泡(pao)應(ying)去(qu)盡(jin)
，晾(liang)片(pian)熱(re)台(tai)不(bu)能(neng)平(ping)放(fang)，應(ying)有(you)45度左右的斜度，利於水流走和蒸發。（2）壞死組織灶
，組織壞死後細胞破壞
、酶的釋放、蛋白遊離

、分解

，複雜的肽鏈殘段（如Fc段）可能與一抗或/和二抗結合導致最終著色。解決辦法是在選擇染色切片時應避免選擇壞死組織較多的切片。（3）製作APES膠片時，膠的濃度太高
，幹燥後在玻片上留下白色小點，顯色時白色小點著色。解決辦法是按照標準的製備方法進行，即5%鹽酸酒精（5ml鹽酸+95%酒精95ml）浸泡玻片4小時、熱水衝洗玻片1小時、蒸餾水洗玻片1分鍾
、丙酮浸泡玻片5秒鍾後空氣幹燥（室溫）、2% APES（2ml APES+98ml丙酮）浸泡玻片5分鍾
、玻片過一下丙酮（1-2秒鍾）、玻片過一下蒸餾水（1-2秒鍾）
、37 度過夜幹燥、室溫儲存備用。如果製片過程中，因丙酮逐漸揮發而膠變濃時可適當加入一些丙酮。

 

5
、間質著色

 

      著(zhe)色(se)部(bu)位(wei)主(zhu)要(yao)在(zai)間(jian)質(zhi)
，間(jian)質(zhi)著(zhe)色(se)的(de)原(yuan)因(yin)很(hen)多(duo)，如(ru)抗(kang)體(ti)與(yu)組(zu)織(zhi)中(zhong)的(de)蛋(dan)白(bai)質(zhi)因(yin)蛋(dan)白(bai)疏(shu)水(shui)基(ji)團(tuan)相(xiang)互(hu)作(zuo)用(yong)形(xing)成(cheng)非(fei)特(te)異(yi)性(xing)的(de)連(lian)接(jie)而(er)著(zhe)色(se)
，加(jia)一(yi)抗(kang)前(qian)的(de)血(xue)清(qing)封(feng)閉(bi)這(zhe)一(yi)步(bu)就(jiu)是(shi)為(wei)了(le)避(bi)免(mian)非(fei)特(te)異(yi)型(xing)的(de)結(jie)合(he)。又(you)如(ru)血(xue)清(qing)中(zhong)的(de)免(mian)疫(yi)球(qiu)蛋(dan)白(bai)常(chang)常(chang)滲(shen)出(chu)到(dao)組(zu)織(zhi)間(jian)質(zhi)
，很(hen)容(rong)易(yi)與(yu)抗(kang)體(ti)結(jie)合(he)，造(zao)成(cheng)間(jian)質(zhi)著(zhe)色(se)

，特(te)別(bie)是(shi)lambda和kappa染ran色se時shi。當dang甲jia狀zhuang腺xian膠jiao質zhi外wai溢yi到dao組zu織zhi間jian質zhi時shi，做zuo甲jia狀zhuang腺xian球qiu蛋dan白bai染ran色se也ye會hui出chu現xian間jian質zhi著zhe色se。抗kang體ti不bu純chun或huo抗kang體ti被bei汙wu染ran也ye可ke出chu現xian間jian質zhi著zhe色se，我wo們men曾zeng遇yu到daoCD20抗體不純，除了染上B細胞外還染上了間質。

 

6、細胞漿著色

 

      胞漿著色是所有“雜音”染ran色se中zhong最zui具ju有you欺qi騙pian性xing的de著zhe色se
，著zhe色se區qu局ju限xian在zai細xi胞bao內nei
，間jian質zhi無wu著zhe色se
，看kan上shang去qu與yu真zhen實shi的de免mian疫yi反fan應ying著zhe色se幾ji乎hu一yi樣yang
，很hen難nan區qu別bie。胞bao漿jiang裏li含han有you較jiao多duo的de蛋dan白bai質zhi，因yin此ci
，很hen多duo非fei特te異yi性xing的de染ran色se除chu了le見jian於yu間jian質zhi也ye可ke以yi出chu現xian在zai胞bao漿jiang中zhong。這zhe種zhong原yuan因yin造zao成cheng的de著zhe色se，可ke以yi通tong過guo血xue清qing封feng閉bi解jie決jue。還hai有you因yin內nei源yuan酶mei造zao成cheng的de著zhe色se
，如ru血xue紅hong蛋dan白bai（紅細胞）、肌紅蛋白（肌細胞）、細胞色素（粒細胞
、單核細胞）
、過氧化氫酶（肝、腎），這些可用過氧化氫進行封閉。巨噬細胞吞噬各種抗原物質或Fc片pian斷duan而er出chu現xian胞bao漿jiang著zhe色se，這zhe種zhong著zhe色se不bu易yi避bi免mian

，但dan可ke以yi通tong過guo形xing態tai學xue辨bian認ren出chu巨ju噬shi細xi胞bao而er引yin起qi重zhong視shi。內nei源yuan性xing生sheng物wu素su的de著zhe色se最zui具ju有you欺qi騙pian性xing
，因yin為wei它ta廣guang泛fan的de存cun在zai於yu組zu織zhi細xi胞bao中zhong，我wo們men研yan究jiu結jie果guo顯xian示shi：冰(bing)凍(dong)組(zu)織(zhi)中(zhong)存(cun)在(zai)內(nei)源(yuan)性(xing)生(sheng)物(wu)素(su)，經(jing)福(fu)馬(ma)林(lin)固(gu)定(ding)石(shi)蠟(la)包(bao)埋(mai)後(hou)生(sheng)物(wu)素(su)被(bei)封(feng)閉(bi)
，加(jia)熱(re)抗(kang)原(yuan)修(xiu)複(fu)後(hou)造(zao)成(cheng)內(nei)源(yuan)性(xing)生(sheng)物(wu)素(su)暴(bao)露(lu)
，內(nei)源(yuan)性(xing)生(sheng)物(wu)素(su)暴(bao)露(lu)的(de)強(qiang)度(du)在(zai)不(bu)同(tong)的(de)組(zu)織(zhi)有(you)所(suo)不(bu)同(tong)，從(cong)弱(ruo)陽(yang)性(xing)（+）到強陽性（+++），neiyuanxingshengwusuzaizuzhizhongdefenbuxingshi，jiyousanzaifenbuyeyoumimanfenbu
，zhuyaoyikelizhuangxingshicunzaiyubaojiangzhong
，neiyuanxingshengwusuguangfancunzaiyushangpiyuanxingzuzhi，tebieshixianshangpizuzhi
，yicunzaibufenfeishangpizuzhi，neiyuanxingshengwusubujincunzairentizuzhiyecunzaidashuzuzhi，neiyuanxingshengwusubaoludeqiangruoyuxiufuyeyouguan
，qiqiangduzengjiayiciwei：檸檬酸、EDTA、EGTA，熱抗原修複暴露的內源性生物素可被雞蛋清封閉，非生物素檢測係統Polymer兩步法（EliVision
、EnVision）可避免生物素幹擾。

 

7、細胞核著色

 

      不適當的組織處理可以出現細胞核著色
，如組織在二甲苯裏浸泡時間太長（如從星期五浸泡到下星期一）
、緩衝液中浸泡時間太長、組織變幹
、微波修複液的pH值和修複時間不當或修複過程中修複液留下得太少，未沒過組織等。解決辦法是嚴格按照操作常規進行工作。