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紫外光激發熒光物質放射熒光示意圖
免疫熒光實驗的主要步驟包括細胞片製備、固定及通透（或稱為透化）、封閉、抗體孵育及熒光檢測等。細胞片製備（通俗的說法是細胞爬片）是shi免mian疫yi熒ying光guang實shi驗yan的de第di一yi步bu，細xi胞bao片pian的de質zhi量liang對dui實shi驗yan的de成cheng敗bai至zhi關guan重zhong要yao，原yuan因yin很hen簡jian單dan，如ru果guo發fa生sheng細xi胞bao掉diao片pian，一yi切qie都dou無wu從cong談tan起qi。這zhe一yi步bu關guan鍵jian的de是shi玻bo片pian（Slides or Coverslips）的(de)處(chu)理(li)以(yi)及(ji)細(xi)胞(bao)的(de)活(huo)力(li)，有(you)人(ren)根(gen)據(ju)成(cheng)功(gong)經(jing)驗(yan)總(zong)結(jie)出(chu)許(xu)多(duo)有(you)益(yi)的(de)細(xi)節(jie)或(huo)小(xiao)竅(qiao)門(men)，非(fei)常(chang)值(zhi)得(de)借(jie)鑒(jian)。固(gu)定(ding)和(he)通(tong)透(tou)步(bu)驟(zhou)最(zui)重(zhong)要(yao)的(de)是(shi)根(gen)據(ju)所(suo)研(yan)究(jiu)抗(kang)原(yuan)的(de)性(xing)質(zhi)選(xuan)擇(ze)適(shi)當(dang)的(de)固(gu)定(ding)方(fang)法(fa)，合(he)適(shi)的(de)固(gu)定(ding)劑(ji)和(he)固(gu)定(ding)程(cheng)序(xu)對(dui)於(yu)獲(huo)得(de)好(hao)的(de)實(shi)驗(yan)結(jie)果(guo)是(shi)非(fei)常(chang)重(zhong)要(yao)的(de)。免(mian)疫(yi)熒(ying)光(guang)中(zhong)的(de)封(feng)閉(bi)和(he)抗(kang)體(ti)孵(fu)育(yu)與(yu)其(qi)它(ta)方(fang)法(fa)（如ELISA或Western Blot）zhongdexiangtongbuzhoushileiside，zuizhongyaodequbiezaiyumianyiyingguangshiyanzhongyaoyongdaoyingguangkangti，yincibixujinjibiguangcaozuo，ciwaikangtinongdudexuanzekenenggengjiaguanjian。zuihouxuyaozhuyideshi，biaojihaoyingguangdexibaopianyingjinzaoguancha，huozheyongfengpianjifengpianhouzai4℃或-20℃避光保存，以免因標記蛋白解離或熒光減弱而影響實驗結果。
由於操作步驟比較多，同時在分析結果時無法像WB那(na)樣(yang)可(ke)以(yi)根(gen)據(ju)分(fen)子(zi)量(liang)的(de)大(da)小(xiao)區(qu)分(fen)非(fei)特(te)異(yi)性(xing)識(shi)別(bie)，所(suo)以(yi)要(yao)得(de)到(dao)一(yi)個(ge)完(wan)美(mei)的(de)免(mian)疫(yi)熒(ying)光(guang)實(shi)驗(yan)結(jie)果(guo)，除(chu)了(le)需(xu)要(yao)高(gao)質(zhi)量(liang)的(de)抗(kang)體(ti)，以(yi)及(ji)對(dui)實(shi)驗(yan)條(tiao)件(jian)進(jin)行(xing)反(fan)複(fu)優(you)化(hua)外(wai)，還(hai)必(bi)須(xu)設(she)立(li)嚴(yan)謹(jin)的(de)實(shi)驗(yan)對(dui)照(zhao)。總(zong)之(zhi)，免(mian)疫(yi)熒(ying)光(guang)實(shi)驗(yan)從(cong)細(xi)胞(bao)樣(yang)品(pin)處(chu)理(li)、固定、封閉、抗體孵育到最後的封片及觀察拍照，每步都非常關鍵，需要嚴格控製實驗流程中每個步驟的質量，才能最終達到你的實驗目的。
基本實驗步驟：
（1） 細(xi)胞(bao)準(zhun)備(bei)。對(dui)單(dan)層(ceng)生(sheng)長(chang)細(xi)胞(bao)，在(zai)傳(chuan)代(dai)培(pei)養(yang)時(shi)，將(jiang)細(xi)胞(bao)接(jie)種(zhong)到(dao)預(yu)先(xian)放(fang)置(zhi)有(you)處(chu)理(li)過(guo)的(de)蓋(gai)玻(bo)片(pian)的(de)培(pei)養(yang)皿(min)中(zhong)，待(dai)細(xi)胞(bao)接(jie)近(jin)長(chang)成(cheng)單(dan)層(ceng)後(hou)取(qu)出(chu)蓋(gai)玻(bo)片(pian)，PBS洗兩次；對懸浮生長細胞，取對數生長細胞，用PBS離心洗滌（1000rpm,5min）2次，用細胞離心甩片機製備細胞片或直接製備細胞塗片。
（2） 固定。根據需要選擇適當的固定劑固定細胞。固定完畢後的細胞可置於含疊氮納的PBS中4℃保存3個月。PBS洗滌3×5 min.
（3） 通透。使用交聯劑（如多聚甲醛）gudinghoudexibao，yibanxuyaozaijiarukangtifuyuqian，duixibaojinxingtongtouchuli，yibaozhengkangtinenggoudaodakangyuanbuwei。xuanzetongtoujiyingchongfenkaolvkangyuandanbaidexingzhi。tongtoudeshijianyibanzai5-15min.通透後用PBS洗滌3×5 min.
（4） 封閉。使用封閉液對細胞進行封閉，時間一般為30min.
（5） 一抗結合。室溫孵育1h或者4℃過夜。PBST漂洗3次，每次衝洗5min.
（6） 二抗結合。間接免疫熒光需要使用二抗。室溫避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次衝洗5min後，再用蒸餾水漂洗一次。
（7） 封片及檢測。滴加封片劑一滴，封片，熒光顯微鏡檢查。
（一）細胞準備
用yong於yu免mian疫yi熒ying光guang實shi驗yan的de細xi胞bao可ke以yi是shi直zhi接jie生sheng長chang在zai蓋gai玻bo片pian上shang的de貼tie壁bi細xi胞bao，也ye可ke以yi是shi經jing過guo離li心xin後hou塗tu片pian的de懸xuan浮fu細xi胞bao或huo者zhe是shi將jiang取qu自zi體ti內nei的de組zu織zhi細xi胞bao懸xuan液ye離li心xin後hou塗tu片pian。貼tie壁bi良liang好hao的de細xi胞bao一yi般ban在zai培pei養yang時shi直zhi接jie放fang入rucoverslipsrangxibaoshengchangzaiqishangjike，jinliangbimianshiyongtiebixingnengbuhaodexibaojinxingmianyiyingguangshiyan，yimianhouxudepiaoxicaozuoyinqixibaotuoluo。shaoshushiyanxuyaoshiyongzheleixibaohuozhexuanfuxibaojinxingmianyiyingguangguancha，jianyishiyongxibaolixinshuaipianjizhibeixibaopianhuozhijiezhibeixibaotupian。
（二）固定和通透
除研究細胞表麵抗原或不穩定抗原可不固定外，一般均應固定。固定的目的有三：
①防止細胞從玻片上脫落；
②除去防礙抗原-抗體結合的類脂；
③使標本易於保存。
標本的固定原則是：
①不能損傷細胞內的抗原；
②不能凝集蛋白質；
③應保持細胞和亞細胞結構；
④固定後應保持通透性，以保證抗體自由進入所有細胞與亞細胞組分與抗原結合。
常用的固定劑有多種，應根據所研究抗原的性質和所使用的抗體特性選擇適當的固定劑。通常固定方法可以分為兩類：有you機ji溶rong劑ji和he交jiao聯lian劑ji。有you機ji溶rong劑ji如ru甲jia醇chun和he丙bing酮tong等deng可ke去qu除chu類lei脂zhi並bing使shi細xi胞bao脫tuo水shui，同tong時shi將jiang細xi胞bao結jie構gou蛋dan白bai沉chen澱dian。交jiao聯lian劑ji如ru多duo聚ju甲jia醛quan通tong常chang通tong過guo自zi由you氨an基ji酸suan基ji團tuan形xing成cheng分fen子zi間jian橋qiao連lian，從cong而er產chan生sheng一yi種zhong抗kang原yuan相xiang互hu連lian接jie的de網wang絡luo結jie構gou。交jiao聯lian劑ji比bi有you機ji溶rong劑ji更geng易yi於yu保bao持chi細xi胞bao的de結jie構gou，但dan因yin為wei交jiao聯lian阻zu礙ai抗kang體ti結jie合he，可ke能neng會hui降jiang低di一yi些xie細xi胞bao組zu分fen的de抗kang原yuan性xing，因yin此ci需xu要yao增zeng加jia一yi個ge通tong透tou步bu驟zhou以yi使shi抗kang體ti能neng夠gou進jin入ru標biao本ben。兩liang種zhong固gu定ding方fang法fa都dou可ke能neng使shi蛋dan白bai抗kang原yuan變bian性xing，因yin此ci使shi用yong變bian性xing蛋dan白bai作zuo為wei抗kang原yuan生sheng產chan的de抗kang體ti在zai免mian疫yi熒ying光guang中zhong可ke能neng更geng為wei有you效xiao。
最常用的固定劑有多聚甲醛和甲醇，少數情況也使用乙醇，丙酮及戊二醛等進行固定。通常，細胞結構抗原、病毒及一些酶類抗原使用丙酮、乙yi醇chun及ji高gao濃nong度du的de甲jia醛quan固gu定ding可ke獲huo得de較jiao好hao的de結jie果guo，而er細xi胞bao膜mo相xiang關guan組zu分fen抗kang原yuan一yi般ban以yi多duo聚ju甲jia醛quan固gu定ding。細xi胞bao器qi和he細xi胞bao顆ke粒li內nei的de抗kang原yuan一yi般ban也ye用yong多duo聚ju甲jia醛quan固gu定ding，並bing需xu要yao進jin行xing通tong透tou以yi使shi抗kang體ti能neng達da到dao抗kang原yuan表biao位wei。
通(tong)透(tou)步(bu)驟(zhou)隻(zhi)在(zai)檢(jian)測(ce)細(xi)胞(bao)內(nei)抗(kang)原(yuan)表(biao)位(wei)的(de)時(shi)候(hou)才(cai)需(xu)要(yao)，因(yin)為(wei)抗(kang)體(ti)需(xu)要(yao)進(jin)入(ru)細(xi)胞(bao)內(nei)部(bu)去(qu)檢(jian)測(ce)蛋(dan)白(bai)。但(dan)是(shi)，如(ru)果(guo)待(dai)檢(jian)測(ce)的(de)是(shi)跨(kua)膜(mo)蛋(dan)白(bai)，且(qie)其(qi)抗(kang)原(yuan)表(biao)位(wei)處(chu)於(yu)胞(bao)質(zhi)內(nei)區(qu)域(yu)，則(ze)同(tong)樣(yang)需(xu)要(yao)對(dui)細(xi)胞(bao)進(jin)行(xing)通(tong)透(tou)。相(xiang)反(fan)，如(ru)果(guo)所(suo)檢(jian)測(ce)的(de)抗(kang)原(yuan)表(biao)位(wei)位(wei)於(yu)膜(mo)蛋(dan)白(bai)的(de)胞(bao)外(wai)段(duan)，則(ze)不(bu)需(xu)要(yao)進(jin)行(xing)通(tong)透(tou)。丙(bing)酮(tong)本(ben)身(shen)具(ju)有(you)通(tong)透(tou)作(zuo)用(yong)，因(yin)此(ci)用(yong)丙(bing)酮(tong)作(zuo)為(wei)固(gu)定(ding)劑(ji)時(shi)是(shi)不(bu)需(xu)要(yao)通(tong)透(tou)的(de)。甲(jia)醇(chun)同(tong)樣(yang)具(ju)有(you)通(tong)透(tou)作(zuo)用(yong)，但(dan)有(you)些(xie)場(chang)合(he)並(bing)不(bu)適(shi)合(he)用(yong)甲(jia)醇(chun)，因(yin)為(wei)一(yi)些(xie)表(biao)位(wei)對(dui)甲(jia)醇(chun)非(fei)常(chang)敏(min)感(gan)。常(chang)用(yong)的(de)通(tong)透(tou)劑(ji)是(shi)去(qu)垢(gou)劑(ji)，如(ru)Triton ,NP-40,以及Tween 20, Saponin, Digitonin 和 Leucoperm等。Triton和NP-40屬(shu)於(yu)烈(lie)性(xing)去(qu)垢(gou)劑(ji)，可(ke)部(bu)分(fen)溶(rong)解(jie)細(xi)胞(bao)核(he)膜(mo)，因(yin)此(ci)非(fei)常(chang)適(shi)合(he)核(he)抗(kang)原(yuan)檢(jian)測(ce)。但(dan)應(ying)該(gai)注(zhu)意(yi)的(de)是(shi)，如(ru)果(guo)在(zai)高(gao)濃(nong)度(du)下(xia)使(shi)用(yong)或(huo)者(zhe)作(zuo)用(yong)時(shi)間(jian)過(guo)長(chang)，它(ta)們(men)將(jiang)破(po)壞(huai)蛋(dan)白(bai)，從(cong)而(er)影(ying)響(xiang)實(shi)驗(yan)結(jie)果(guo)。Triton X-100是shi最zui常chang用yong的de通tong透tou劑ji，但dan是shi它ta將jiang破po壞huai細xi胞bao膜mo，因yin此ci不bu適shi用yong於yu細xi胞bao膜mo相xiang關guan抗kang原yuan。後hou麵mian一yi組zu去qu垢gou劑ji要yao溫wen和he得de多duo，它ta們men可ke以yi在zai細xi胞bao質zhi膜mo上shang形xing成cheng足zu夠gou大da的de孔kong隙xi以yi允yun許xu抗kang體ti通tong過guo，但dan是shi不bu會hui溶rong解jie細xi胞bao質zhi膜mo。適shi於yu胞bao質zhi抗kang原yuan或huo者zhe質zhi膜mo上shang靠kao近jin胞bao質zhi一yi麵mian的de抗kang原yuan，也ye適shi於yu可ke溶rong性xing的de核he抗kang原yuan。
一yi般ban的de操cao作zuo程cheng序xu是shi先xian固gu定ding後hou通tong透tou，但dan針zhen對dui有you些xie水shui不bu溶rong性xing的de目mu的de抗kang原yuan的de檢jian測ce宜yi先xian通tong透tou再zai固gu定ding，這zhe樣yang做zuo的de原yuan因yin主zhu要yao是shi可ke以yi通tong過guo通tong透tou去qu除chu許xu多duo水shui溶rong性xing的de蛋dan白bai，從cong而er大da大da減jian少shao了le免mian疫yi熒ying光guang的de背bei景jing和he非fei特te異yi性xing信xin號hao。固gu定ding後hou以yi冷lengPBS液漂洗，最後以蒸餾水衝洗，防止自發性熒光。
（三）封閉
封閉的目的是為了減少抗體的非特異性結合，最常用的封閉劑為1% BSA, PBS pH 7.5,其他可選擇的封閉劑還有 1% gelatin, 1%bovine 或與二抗種屬相同的血清（3-10%）等。
（四）抗體孵育
zhijiemianyiyingguangfazhongdeyikanghejianjiemianyiyingguangfazhongdeerkangdoushiyingguangkangti，yincizaizhexiekangtifuyudeshihoubixuzhuyibiguang。ciwai，weibaozhengjiehezhilianghefangzhiganzao，kangtifuyuyingjinliangzaishihezhongjinxing。
（五）封片及熒光觀察
標(biao)記(ji)好(hao)熒(ying)光(guang)的(de)細(xi)胞(bao)片(pian)原(yuan)則(ze)上(shang)可(ke)以(yi)直(zhi)接(jie)進(jin)行(xing)觀(guan)察(cha)，特(te)別(bie)是(shi)有(you)時(shi)候(hou)封(feng)片(pian)不(bu)當(dang)反(fan)而(er)使(shi)得(de)前(qian)功(gong)盡(jin)棄(qi)。但(dan)在(zai)絕(jue)大(da)多(duo)數(shu)情(qing)況(kuang)下(xia)，為(wei)了(le)保(bao)存(cun)結(jie)果(guo)，以(yi)便(bian)進(jin)一(yi)步(bu)觀(guan)察(cha)、照像、tongjifenxideng，xuzuofengpianchuli。changguidefangfashicaiyongganyouhuozhongxingshuzhifengpian，weilezengqiangfengpiandexiaoguo，wangwangxuyaozaifengpianshitianjiateshudekangyingguangcuimieji。
（六）標本保存
由you於yu熒ying光guang色se素su和he蛋dan白bai質zhi分fen子zi的de穩wen定ding性xing都dou是shi相xiang對dui的de，因yin此ci隨sui著zhe保bao存cun時shi間jian的de延yan長chang，在zai各ge種zhong條tiao件jian影ying響xiang下xia，標biao記ji蛋dan白bai可ke能neng變bian性xing解jie離li，失shi去qu其qi應ying有you的de亮liang度du和he特te異yi性xing。因yin此ci給gei標biao本ben的de 保存帶來一定的困難，所以在標本進行熒光染色之後應立即觀察。由於性能良好的抗熒光淬滅劑的出現，熒光標記的標本可以在低溫（4℃或-20℃）下(xia)保(bao)存(cun)相(xiang)當(dang)長(chang)的(de)時(shi)間(jian)。在(zai)某(mou)些(xie)情(qing)形(xing)下(xia)，考(kao)慮(lv)到(dao)實(shi)驗(yan)的(de)成(cheng)本(ben)及(ji)實(shi)驗(yan)條(tiao)件(jian)，也(ye)可(ke)以(yi)采(cai)取(qu)權(quan)宜(yi)的(de)辦(ban)法(fa)，比(bi)如(ru)固(gu)定(ding)標(biao)本(ben)片(pian)後(hou)低(di)溫(wen)保(bao)存(cun)，在(zai)需(xu)要(yao)時(shi)再(zai)進(jin)行(xing)熒(ying)光(guang)標(biao)記(ji)，即(ji)隨(sui)用(yong)隨(sui)染(ran)。
