液相常見的壓力問題，基線問題，峰形問題等都有解答，小夥伴們趕緊尋找答案吧。話不多說，直接上幹貨。何謂反相柱、正相柱？
答：“反相”和“正相”degainianshiyexiangsepufazaoqitichudegainian，dangshijianhexiangsepuzhushangweichuxian，gudingxiangbeitufuzaizaitibiaomian，jiyiliushi，weicikexuejiaduiliudongxiangshiyonggeichulehelidejianyi：流(liu)動(dong)相(xiang)極(ji)性(xing)與(yu)固(gu)定(ding)液(ye)極(ji)性(xing)應(ying)具(ju)有(you)較(jiao)大(da)差(cha)別(bie)，以(yi)減(jian)少(shao)固(gu)定(ding)液(ye)流(liu)失(shi)。固(gu)定(ding)相(xiang)極(ji)性(xing)弱(ruo)於(yu)流(liu)動(dong)相(xiang)時(shi)的(de)液(ye)相(xiang)色(se)譜(pu)法(fa)被(bei)稱(cheng)為(wei)反(fan)相(xiang)色(se)譜(pu)法(fa)，固(gu)定(ding)相(xiang)極(ji)性(xing)強(qiang)於(yu)流(liu)動(dong)相(xiang)時(shi)的(de)液(ye)相(xiang)色(se)譜(pu)法(fa)被(bei)稱(cheng)為(wei)正(zheng)相(xiang)色(se)譜(pu)法(fa)。盡(jin)管(guan)目(mu)前(qian)鍵(jian)合(he)相(xiang)色(se)譜(pu)柱(zhu)已(yi)成(cheng)為(wei)主(zhu)流(liu)，但(dan)這(zhe)一(yi)概(gai)念(nian)在(zai)色(se)譜(pu)方(fang)法(fa)開(kai)發(fa)、預測出峰順序等方麵具有重要意義。
由上麵的介紹可知具體的色譜方法、色譜柱屬於正相還是反相不僅取決於固定相極性，同時還取決於流動相極性。C18(矽膠鍵合十八烷基矽烷)、C8(矽膠鍵合辛基矽烷)、PH(矽膠鍵合苯基矽烷)等色譜柱，由於固定相極性極低，比目前已知的任何流動相的極性都要低，因而是標準的反相柱；Silica(矽膠)、NH2(矽膠鍵合氨丙基矽烷)具有較高的極性，主要用於分離帶有極性基團的化合物，所用流動相的極性通常低於這些固定相，因而是標準的正相柱。CN(矽膠鍵合腈丙基)的極性適中，當流動相極性超過CN時，它屬於反相柱，反之則是正相柱。色譜柱規格對分析結果會產生何種影響？
答：色譜柱內徑決定載樣量，載樣量與內徑的平方成正比；色譜柱長度與塔板數成正比，與柱壓成正比；粒徑影響渦流擴散相，粒徑越小渦流擴散相越小，柱效越高，粒徑與柱效近似成反比；粒徑越小，壓力也越大，壓力與粒徑的平方成反比。填料孔徑對分析對象的分子量有限製，當孔徑為分析物尺寸的5倍以上時，分析物才能順利通過孔隙，孔徑處於60~120 Å的色譜柱適用於相對分子量小於10000的分析物，孔徑為300 Å的色譜柱可以滿足分子量處於10000以上的大分子化合物分析。液相色譜分析中如何才能提高分離度？答：下式為分離度計算公式
N：柱效(Efficiency)反映色譜柱性能，柱效越高，分離度越好。在其他條件恒定的情況下，塔板數增加一倍，分離度僅提高40%。操作中，可通過下麵兩種方式增加塔板數進而提高分離度：其一，使用長柱或雙柱串聯，但也會使分離時間大大延長；其二，使用細粒徑填料的色譜柱，但這需要耐更高壓力的液相色譜係統。相比之下後者更為可取。
α：選擇性(selectivity)是指色譜柱-流動相體係分離兩個化合物的能力。選擇性主要與固定相、流動相組成以及柱溫等因素有關，與保留值也密切相關，其中固定相和流動相組成影響較大。以最常見的反相模式為例，反相柱(包括C18、C8、PH等)是以分配作用對化合物進行保留的，不同化合物的分離是基於它們在鍵合相與流動相中分配係數的差異，如果兩種化合物的水溶性、在烷烴-水體係的分配係數等方麵存在明顯差異，那麼這些化合物通常是能夠利用反相柱達到分離；PH柱對具有苯環的化合物具有特殊保留。
正相模式下，矽膠柱、胺基柱、氰基柱與帶有極性基團的化合物之間存在極性相互作用，對化合物的基團具有選擇性，常常用於結構類似物、異構體化合物的分離。流動相方麵，降低流動相的洗脫強度通常可以增大分離度；而(er)有(you)機(ji)溶(rong)劑(ji)類(lei)型(xing)也(ye)會(hui)影(ying)響(xiang)分(fen)離(li)，比(bi)如(ru)反(fan)相(xiang)條(tiao)件(jian)下(xia)，乙(yi)腈(jing)和(he)甲(jia)醇(chun)的(de)選(xuan)擇(ze)性(xing)就(jiu)存(cun)在(zai)很(hen)大(da)差(cha)異(yi)，這(zhe)種(zhong)差(cha)異(yi)需(xu)要(yao)在(zai)實(shi)踐(jian)中(zhong)摸(mo)索(suo)，但(dan)無(wu)論(lun)如(ru)何(he)，多(duo)種(zhong)溶(rong)劑(ji)類(lei)型(xing)帶(dai)給(gei)我(wo)們(men)更(geng)多(duo)的(de)實(shi)現(xian)分(fen)離(li)的(de)可(ke)能(neng)。
k：隨著容量因子k的增大，分離度也隨之增加，這種影響在k值較低時非常明顯，當k值大於10時，k值增加對分離度的影響就不再顯著，這就告誡無原則地提高k值以增大分離度是沒有意義的。增加鍵合相密度能夠提高k值；另外改變鍵合基團類型也能改變k值，比如在反相色譜中，隨著鍵合相碳鏈長度的增加，kzhizhujianzengda。sepufengdefengxingshizenyanghengliangde？youheguiding？lilunshangjiang，sepufengyingfuhegaosiquxianfenbu，ranershijishangrenhesepufengdouduigaosiquxianfenbucunzaiyidingdepianli，yijibuduicheng。fengtuoweikeyiyongbuduichengyinzi(As)或USP拖尾因子(Tf)來衡量，顯然不對稱因子的說法更準確，因為色譜峰存在前延、完美對稱、拖尾三種形態。一般來說，製藥行業以USP拖尾因子作為評測標準，而其他行業則多采用As來測定峰形。
對於藥物分析，通常有明確的規定，Tf應處於某一範圍之間，比如我國藥典規定某些藥物的拖尾因子應處於0.95-1.05之間。其他行業尚無較為明確的規定。什麼是梯度洗脫？什麼情況下使用梯度洗脫？
答：為了改善分析結果，某些操作需要連續改變流動相中各溶劑組分的比例以連續改變流動相的極性，使每個分析組分都有合適的容量因子k，並使樣品種的所有組分可在最短時間內實現最佳分離，這種洗脫方式稱為梯度洗脫。
梯度洗脫可在下列情形中發揮重要作用：
A 在等度下具有較寬k值的多種樣品分析。
B 大分子樣品分析。
C 樣品含有強保留的幹擾物，在目標化合物出峰後設置梯度洗脫，將幹擾物洗脫出來，以免其影響下一次數據采集。
D 分析方法建立時，不知道其洗脫情況，使用梯度洗脫，找出其較優的洗脫條件。何謂封端？封端的意義是什麼？矽膠表麵的矽羥基(Si-OH)密度為8 μmol/m2，由於空間位阻的存在，矽烷化鍵合反應最多隻能覆蓋50%deguiqiangji，chaoguoyibandeguiqiangjishihuoxingguiqiangji。zhexieguiqiangjiyuhuahewudejixingjituancunzaijixingxianghuzuoyonghelizijiaohuanzuoyong，weihuahewudebaoliuzengjialebubeiqiwangdezuoyongli，wangwanghuiyingxiangfengxing。yongduanlianlvguiwan（如三甲基氯矽烷）鍵合活性的矽羥基，可以減小甚至消除這種影響，這種操作被稱為封端(Endcap)。
封端處理的意義：
抑製了特異性吸附，提高了色譜峰的對稱性，並改善了分離效果；
在一定程度上掩蔽了矽膠表麵，使其對堿性環境的耐受性增強；
通過空間位阻掩蓋了鍵合反應形成的Si-O-Si鍵，使其對酸性環境的耐受性增強；kenenghuiyingxiangduijixingyangpindexuanzexing。zhuchuangtaxianhejianhexiangtaxianzhuchuangtaxianshizhisepuzhushiyongyiduanshijianhousepuzhurukouchudezhuchuangchanshengkejiandekongxi。gaikongxidecunzaizengdalesitiji，huidaozhisepuzhuzhuxiaoxiajiang。zaochengzhuchuangtaxiandeyuanyinruxia：
其一，色譜柱填裝時的壓力過低，填裝不緊密，在高壓下使用一段時間，開始出現空隙；
其二，操作壓力超出色譜柱填料的耐壓值，導致填料顆粒破碎產生空隙；
其三，流動相溶解填料導致空隙出現。鍵合相塌陷是指由於流動相極性與鍵合相極性相差太大，鍵合相無法在流動相中充分伸展而倒伏、纏結在一起，比如普通C18在(zai)純(chun)水(shui)相(xiang)條(tiao)件(jian)下(xia)。相(xiang)塌(ta)陷(xian)會(hui)導(dao)致(zhi)色(se)譜(pu)柱(zhu)對(dui)化(hua)合(he)物(wu)的(de)保(bao)留(liu)不(bu)足(zu)。係(xi)統(tong)壓(ya)力(li)升(sheng)高(gao)的(de)原(yuan)因(yin)及(ji)排(pai)除(chu)使(shi)用(yong)者(zhe)通(tong)過(guo)觀(guan)察(cha)儀(yi)器(qi)的(de)係(xi)統(tong)監(jian)測(ce)掌(zhang)握(wo)係(xi)統(tong)的(de)壓(ya)力(li)，如(ru)果(guo)發(fa)現(xian)壓(ya)力(li)偏(pian)高(gao)，不(bu)要(yao)立(li)即(ji)認(ren)為(wei)“柱壓高了”，因為係統壓力通常由柱前壓力、色譜柱壓力和流通池壓力加合而成。此時正確的做法是：在操作條件下，測定係統壓力，得到p總；卸下色譜柱，在相同條件下，測定柱前壓力，得到p前；用兩通將泵流出管路與流通池連接，在操作條件下，測定壓力，得到p(前+後)。通過計算找出壓力高是來自柱前、色譜柱還是柱後。
yishangqingxingjiashemeiyouanzhuangbaohuzhu，ruguoanzhuanglebaohuzhu，yalishenggaoshiyingxianceshibaohuzhudeyali，yibianquerenwentishifoulaizibaohuzhu。xitongyalibuwendingtongchangqingkuangxia，bengyadebiandongzhichaoguole0.5 Mpa，xitongyalijiushuyubuwendingdefanchou。daozhixitongyalibuwendingdezuizhijieyuanyinweiliudongxiangliulianghezuchengshuchudebuwending，erdaozhiliudongxiangshuchubuwendingdeyuanyintongchangbaokuorongjihurongxingjiaocha、係統漏液、係統存在氣泡以及輸液係統部件工作失效。下麵將介紹排除“係統壓力不穩”的方法。
流liu動dong相xiang輸shu出chu不bu穩wen定ding還hai會hui導dao致zhi基ji線xian不bu穩wen定ding以yi及ji保bao留liu時shi間jian變bian化hua等deng現xian象xiang，所suo以yi基ji線xian不bu穩wen定ding或huo保bao留liu時shi間jian不bu重zhong現xian時shi，先xian看kan一yi下xia柱zhu壓ya是shi否fou穩wen定ding，如ru果guo不bu穩wen定ding，三san個ge問wen題ti可ke以yi合he並bing處chu理li。基ji線xian不bu穩wen定ding
基線不穩定是指色譜曲線在較長時間範圍內對響應值的0刻度較大的偏離，通常包括基線漂移(單方向)、基線起伏(規律的上下起伏)、區域寬度極大的色譜峰三種情況
如果基線不穩定同時伴隨壓力波動，請按照“壓力不穩定”進行排查。如果壓力穩定，請按下表中的方法進行排查。
噪聲升高
噪聲（baseline noise）：由檢測器輸出與被測樣品組分無關的無規則波動信號，在特定靈敏度下用響應單位表示。可分為高頻噪聲和短周期噪聲兩種。對於光譜型檢測器，噪聲的正常響應值處於0.000005 V ~ 0.00002 V之間(參考Shimadzu 的HPLC儀器)，高於此值，即可認為噪聲偏高。
噪聲升高時，先按下列步驟排查流動相問題
噪聲升高時，若流動相沒有問題，應排查儀器的問題
柱性能下降
柱性能下降的一個重要現象就是在保留時間基本不發生變化的情況下，色譜峰的區域寬度明顯增大(如下圖)。
當遇到柱效下降，請按下表進行排查和解決
保留時間重現性差
當保留時間的偏差超過2%，可以認為保留時間的重現性差。對於某一個特定的分析，保留時間主要受流動相組成、流速、溫度以及固定相影響，當保留時間發生明顯變化時，應從這幾方麵入手。
A 由流動相造成的保留時間不穩定
B 由固定相造成的保留時間不穩定
峰形不理想理想的色譜峰遵循正態分布，應該符合高斯曲線，是完美而對稱的峰形(如圖A)；然而由於化合物性質的特殊性、色譜柱故障、操作條件等問題存在，峰形可能會不對稱，前延(B)或拖尾(C)。
峰形前延(B)
中藥成分分析項目中，提取溶劑通常為乙醇、甲醇、乙酸乙酯等洗脫強度較強的溶劑，此時易發生“樣品溶劑的洗脫強度遠遠超過流動相”的情況，為避免前延峰出現，可以用通過“流動相稀釋提取液”或降低“進樣體積”的方式。
峰形拖尾(C)
鬼峰鬼峰(Ghost peak)：是對未知來源的色譜峰的統稱。
氣泡峰氣泡峰是指攜帶氣泡的流動相通過檢測器時得到的響應值；這裏的氣泡可能是流動相中釋放的空氣，也可能是有機相遇水放熱而會釋放的有機溶劑分子；氣泡峰往往具有較高的響應值，區域寬度僅為數秒，出峰時間和相應值比較有規律(如下圖)。通常隻有光譜型檢測器才會出氣泡峰。
解決辦法：
脫氣
使用多元梯度時，對每一種組分進行脫氣，排除它們溶解的空氣；
對於預先混合的溶劑，混合後脫氣，排除溶解的空氣和因放熱而揮發出的有機溶劑分子；
前麵的脫氣方式對於預先混合好的混合溶劑，基本可以達到消除氣泡峰的目的；但dan對dui於yu多duo種zhong純chun溶rong劑ji在zai儀yi器qi中zhong混hun合he的de情qing況kuang，混hun合he後hou溶rong劑ji體ti係xi放fang熱re，存cun在zai潛qian在zai的de氣qi泡pao，當dang流liu動dong相xiang流liu出chu色se譜pu柱zhu時shi，壓ya強qiang驟zhou減jian，潛qian在zai的de氣qi泡pao溢yi出chu，被bei檢jian測ce器qi檢jian測ce到dao。為wei了le防fang止zhi這zhe一yi問wen題ti出chu現xian，應ying在zai檢jian測ce器qi出chu口kou連lian接jie一yi段duan內nei徑jing較jiao細xi的de管guan路lu，使shi流liu動dong相xiang通tong過guo檢jian測ce器qi時shi，環huan境jing壓ya強qiang較jiao高gao，氣qi泡pao難nan以yi溢yi出chu，可ke以yi避bi免mian氣qi泡pao峰feng出chu現xian。
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