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牛乳中的蛋白質含量為3%～3.7%，是(shi)主(zhu)要(yao)的(de)含(han)氮(dan)物(wu)質(zhi)，其(qi)中(zhong)主(zhu)要(yao)為(wei)酪(lao)蛋(dan)白(bai)和(he)乳(ru)清(qing)蛋(dan)白(bai)，還(hai)有(you)少(shao)量(liang)的(de)脂(zhi)肪(fang)球(qiu)膜(mo)蛋(dan)白(bai)。乳(ru)蛋(dan)白(bai)就(jiu)整(zheng)體(ti)而(er)言(yan)，富(fu)含(han)必(bi)需(xu)氨(an)基(ji)酸(suan)且(qie)配(pei)比(bi)適(shi)宜(yi)，比(bi)自(zi)然(ran)界(jie)中(zhong)任(ren)何(he)其(qi)他(ta)天(tian)然(ran)食(shi)物(wu)都(dou)多(duo)，但(dan)酪(lao)蛋(dan)白(bai)中(zhong)蛋(dan)氨(an)酸(suan)的(de)含(han)量(liang)卻(que)較(jiao)少(shao)。
在檢驗食品中蛋白質時，通常是先檢定出食品中的總氮量，然後乘以蛋白質換算係數，以此得到蛋白質含量。凱氏定氮法由Kieldahl於1883年首先提出，至今仍被作為標準檢驗方法。凱氏定氮法測定蛋白質分為樣品消化、蒸餾、吸收和滴定過程。
一凱氏定氮法的原理及步驟
danbaizhishihandandeyoujihuahewu。yangpinyunongliusuanhecuihuajiyitongjiarexiaohua，shidanbaizhifenjie，qizhongtanheqingbeiyanghuaweieryanghuatanheshuiyichu，eryangpinzhongdeyoujidanzhuanhuaweian，yuliusuanjieheshengchengliusuanan。ranhoujiajianzhengliushianyouli，yongpengsuanxishouhou，zaiyiliusuanhuoyansuan標準溶液滴定，根據酸的消耗量乘以換算係數（乳及乳製品換算係數為6.38），即為蛋白質的含量。
（1）消化
濃硫酸具有脫水性，使有機物脫水後被炭化為碳、氫、氮dan。濃nong硫liu酸suan又you具ju有you氧yang化hua性xing，可ke將jiang有you機ji物wu炭tan化hua後hou的de碳tan氧yang化hua為wei二er氧yang化hua碳tan，硫liu酸suan則ze被bei還hai原yuan為wei二er氧yang化hua硫liu。二er氧yang化hua硫liu使shi氮dan還hai原yuan為wei氨an，本ben身shen則ze被bei氧yang化hua為wei三氧化硫，氨隨之與硫酸作用生成硫酸銨留在酸性溶液中。
蛋白質+13H2SO4→(NH4)2SO4+6CO2+12SO2+16H2O
消化時加入的硫酸銅是作催化劑，以加速分解反應，還可以加入氧化汞、氧(yang)化(hua)銅(tong)等(deng)作(zuo)催(cui)化(hua)劑(ji)，為(wei)防(fang)止(zhi)汞(gong)的(de)汙(wu)染(ran)，通(tong)常(chang)用(yong)硫(liu)酸(suan)銅(tong)較(jiao)多(duo)。如(ru)果(guo)以(yi)汞(gong)或(huo)汞(gong)化(hua)合(he)物(wu)作(zuo)催(cui)化(hua)劑(ji)，則(ze)消(xiao)化(hua)和(he)加(jia)堿(jian)後(hou)，形(xing)成(cheng)汞(gong)氨(an)化(hua)合(he)物(wu)。此(ci)化(hua)合(he)物(wu)在(zai)蒸(zheng)餾(liu)時(shi)不(bu)能(neng)完(wan)全(quan)分(fen)解(jie)，在(zai)這(zhe)種(zhong)情(qing)況(kuang)下(xia)，必(bi)須(xu)加(jia)入(ru)鋅(xin)粉(fen)或(huo)硫(liu)代(dai)硫(liu)酸(suan)鈉(na)或(huo)硫(liu)化(hua)鈉(na)，使(shi)汞(gong)氨(an)化(hua)合(he)物(wu)分(fen)解(jie)。
C+2CuSO4→Cu2SO4+SO2↑+CO2↑
Cu2SO4+2H2SO4→2CuSO4+2H2O+SO2
有機物消化完後，溶液具有清澈的硫酸銅的藍綠色，同時硫酸銅在下一步蒸餾時可作堿性反應的指示劑。
zaixiaohuaguochengzhongtianjialiusuanjia，yuliusuanfanyingshengchengliusuanqingjia，shiweiletigaorongyefeidian，congertigaofanyingwendu，jiasufanyingguocheng。ciwai，yekeyijialiusuanna、氯化鉀等鹽類來提高沸點。
在消化過程中，隨著硫酸的不斷分解、水分的不斷蒸發，硫酸鉀的濃度逐漸增大，沸點升高，加速了對有機物的分解作用。
加入過氧化氫，是利用其氧化性，以加快反應速度：
2H2O2→O2+2H2O
（2）蒸餾
在消化完全的樣品溶液中加入濃氫氧化鈉使呈堿性，硫酸銨在堿性條件下釋放出氨，通過加熱蒸餾，氨隨水蒸氣蒸出：
(NH4)2SO4+2NaOH →2NH3+Na2SO4+2H2O
（3）吸收
加熱蒸餾時放出的氨可用硼酸溶液進行吸收。溫度過高會使硼酸吸收液對氨的吸收作用減弱，從而造成損失，故一般不超過40 ℃。
2NH3+4H3BO3→(NH4)2B4O7+5H2O
（4）滴定 待dai吸xi收shou完wan全quan後hou，用yong硫liu酸suan或huo鹽yan酸suan標biao準zhun溶rong液ye滴di定ding生sheng成cheng的de硼peng酸suan銨an，屬shu於yu鹽yan類lei的de滴di定ding。硼peng酸suan為wei極ji弱ruo的de酸suan，在zai滴di定ding中zhong並bing不bu影ying響xiang所suo用yong指zhi示shi劑ji的de變bian色se反fan應ying。
(NH4)2B4O7+H2SO4+5H2O→(NH4)2SO4+4H3BO3
(NH4)2B4O7+2HCl+5H2O→2NH4Cl+4H3BO3
（5）計算 根據硫酸或鹽酸溶液消耗的體積，計算總氮含量，再乘以蛋白質係數（乳及乳製品換算係數為6.38），即為粗蛋白的含量。
二注意事項
（1）加入樣品及試劑時，避免黏附在瓶頸上。
（2）加入硫酸鉀的作用：提高硫酸的沸點（338℃），增進反應速度。但過多的硫酸鉀會造成沸點太高。生成的硫酸銨在513℃會分解，故此加入硫酸鉀的量一定要準確。
（3）加入硫酸銅的作用：催化劑，使氧化作用加速。
（4）消xiao化hua時shi，采cai用yong長chang頸jing圓yuan底di凱kai氏shi燒shao瓶ping斜xie支zhi於yu電dian爐lu上shang，其qi操cao作zuo必bi須xu在zai通tong風feng櫥chu中zhong進jin行xing，並bing使shi全quan部bu樣yang品pin浸jin泡pao在zai消xiao化hua液ye中zhong，防fang止zhi樣yang品pin黏nian附fu在zai瓶ping頸jing上shang部bu，以yi致zhi消xiao化hua不bu完wan全quan；在zai消xiao化hua過guo程cheng中zhong，樣yang品pin炭tan化hua變bian黑hei，產chan生sheng泡pao沫mo，這zhe時shi要yao減jian小xiao火huo力li。勿wu使shi黑hei色se物wu質zhi上shang升sheng到dao凱kai氏shi燒shao瓶ping頸jing部bu，待dai消xiao化hua液ye均jun勻yun沸fei騰teng後hou，再zai加jia大da火huo力li，直zhi至zhi消xiao化hua液ye黑hei褐he色se消xiao失shi呈cheng淡dan藍lan色se透tou明ming為wei止zhi。如ru樣yang品pin含han脂zhi肪fang較jiao多duo時shi，應ying適shi當dang增zeng加jia硫liu酸suan量liang，用yong硫liu酸suan量liang少shao時shi，過guo多duo的de硫liu酸suan鉀jia會hui形xing成cheng硫liu酸suan氫qing鉀jia而er不bu與yu氨an作zuo用yong，導dao致zhi氨an損sun失shi。
（5）當樣品消化液渾濁或未澄清透明時，可先將凱氏燒瓶放冷至室溫後，再加入30%的過氧化氫，然後繼續加熱消化；
（6）蒸餾裝置要安裝平穩、牢固、嚴密，各連接部分不能漏氣。水蒸氣發生器裝水不可太滿，加玻璃珠以防爆沸。
（7）蒸餾時，蒸汽要發生均勻、充足，不得停火斷汽，否則蒸餾瓶內壓力降低會發生倒吸；避bi免mian瓶ping中zhong的de液ye體ti發fa泡pao衝chong出chu進jin入ru接jie收shou瓶ping。加jia堿jian量liang要yao足zu，動dong作zuo要yao快kuai，防fang止zhi氨an損sun失shi。冷leng凝ning管guan出chu口kou一yi定ding要yao浸jin入ru吸xi收shou液ye中zhong，防fang止zhi氨an揮hui發fa損sun失shi。要yao保bao證zheng蒸zheng餾liu裝zhuang置zhi不bu能neng漏lou氣qi
（8）蒸餾結束後，應先將吸收液離開冷凝管口，以免發生倒吸。判斷是否蒸餾完全，可用pH試紙測試冷凝管口的冷凝液而確定。
（9）在蒸餾時反應室與外界存在的壓力差，蒸汽可將氨帶出。故蒸餾時，要保證蒸汽均勻、充足，中間不能停止加熱，防止發生倒吸；
三常見問題解答
一、消化過程中容易沾壁怎麼辦？消化後定氮瓶內有黑色殘留物怎麼辦？
解答：稱(cheng)樣(yang)時(shi)需(xu)要(yao)注(zhu)意(yi)切(qie)勿(wu)使(shi)樣(yang)品(pin)粘(zhan)附(fu)在(zai)定(ding)氮(dan)瓶(ping)頸(jing)部(bu)，避(bi)免(mian)因(yin)樣(yang)品(pin)未(wei)消(xiao)化(hua)完(wan)全(quan)而(er)造(zao)成(cheng)結(jie)果(guo)偏(pian)低(di)。消(xiao)化(hua)過(guo)程(cheng)中(zhong)如(ru)果(guo)發(fa)生(sheng)沾(zhan)壁(bi)在(zai)定(ding)氮(dan)瓶(ping)肚(du)上(shang)或(huo)者(zhe)定(ding)氮(dan)瓶(ping)肚(du)上(shang)有(you)黑(hei)色(se)殘(can)留(liu)物(wu)，可(ke)以(yi)在(zai)消(xiao)化(hua)較(jiao)完(wan)全(quan)時(shi)搖(yao)動(dong)定(ding)氮(dan)瓶(ping)，把(ba)定(ding)氮(dan)瓶(ping)肚(du)上(shang)的(de)黑(hei)色(se)物(wu)質(zhi)搖(yao)洗(xi)下(xia)來(lai)。搖(yao)動(dong)的(de)方(fang)法(fa)是(shi)取(qu)下(xia)小(xiao)漏(lou)鬥(dou)，戴(dai)上(shang)防(fang)燙(tang)手(shou)套(tao)，手(shou)掌(zhang)緊(jin)握(wo)瓶(ping)頸(jing)，向(xiang)前(qian)後(hou)側(ce)甩(shuai)，使(shi)瓶(ping)內(nei)液(ye)體(ti)呈(cheng)半(ban)旋(xuan)轉(zhuan)半(ban)振(zhen)蕩(dang)狀(zhuang)態(tai)，注(zhu)意(yi)控(kong)製(zhi)力(li)度(du)不(bu)要(yao)讓(rang)液(ye)體(ti)濺(jian)離(li)瓶(ping)口(kou)。
二、硫酸鉀的作用是催化劑嗎？
解答：liusuanjiadezuoyongshitigaorongyefeidian，congerjiakuaiyoujiwufenjie。danshibunengjiaruguoduodeliusuanjia，fouzehuiyinweiwenduguogao，shishengchengdeliusuananfashengrefenjiechenganerzaochengsunshi。
三、硫酸銅是否是消化終點以及加堿蒸餾時的指示劑？
解答：硫酸銅的作用有三個，分別為：
①催化作用：加速有機物的氧化分解。
②消化完全的指示劑：使液體呈現藍綠色澄清透明狀態。
③蒸餾時堿性反應的指示劑：產生褐色沉澱。
四、混合指示劑必須臨用時混合嗎？
解答：混合指示劑必須臨用時混合。
五、蒸餾的時取下錐形瓶需要用洗瓶衝洗嗎？不衝洗會有誤差嗎？
解答：需要衝洗冷凝管下端以防止產生結果誤差。蒸餾後移動蒸餾液接收瓶,液麵離開冷凝管下端,再蒸餾1min。然後用少量水衝洗冷凝管下端外部,然後取下蒸餾液接收瓶。
六、蒸餾儀器的檢漏如何操作？
解答：可以將蒸餾裝置連接好後，在接口以及瓶塞等可能漏氣的地方滴加少量水，打開電爐加熱，觀察有無氣泡產生。
七、硼酸可以多加嗎？
解答：不可以。按國標的要求正確操作，10mL硼酸足夠。
八、滴定時消耗了很多鹽酸溶液，能否換濃度高的鹽酸溶液滴定？
解答：不能更改國標給出的滴定液濃度。蛋白質含量較高的樣品可以適當減少稱樣量，或合理範圍內減少吸取消化液的體積V3。
九、空白消耗標準滴定液的體積指的是什麼？
解答：試劑空白實驗消耗的標準滴定溶液的體積就是空白體積。
十、同時有兩種蛋白怎麼換算？
解答：同時含有多種蛋白質，且折算係數不相同時可以按複合配方食品換算蛋白質係數。
凱氏定氮儀使用常見問題解答
1、 凱氏定氮儀在蒸餾時翻滾劇烈，會對操作者構成危險嗎？
答：一般不會，凱氏定氮儀在蒸餾時翻滾劇烈，是水蒸氣大量進入消化管液體翻滾，並非劇烈反應造成；而且儀器有超壓保護裝置，可以保持管路內部常壓，避免危險。
2、 凱氏定氮儀工作中對水質有什麼要求？
答：凱氏定氮儀的蒸餾水桶內要裝蒸餾水或純水，機器長期不用要將蒸餾器裏水放掉。
3、 凱氏定氮儀開機沒聲音是怎麼回事？
答：凱氏定氮儀開機沒聲音，如果機器電源開關內紅燈亮，說明是定氮儀內保險管燒斷了，保險管位置在機器內部靠近電源開關接口5公分處黑色殼子內。
4、 凱氏定氮儀開機後蒸餾器內不加水怎麼解決？
答：開機半分鍾後檢查蒸餾水桶是否漏氣，能被氣充鼓是正常；檢查蒸餾水桶內水位是否超過三分之一，不夠補齊；檢查蒸餾水桶的位置，低於放置儀器的台麵，壓力不夠，加不上水；檢查蒸餾水桶進氣、進液管是否接錯，接錯桶內會產生氣泡並發出聲響；檢查排水閥，應呈關閉狀態。
5、 凱氏定氮儀蒸鍋不加熱，不能產生蒸氣，為什麼？
答：如ru果guo機ji器qi能neng正zheng常chang加jia堿jian，不bu能neng加jia熱re出chu蒸zheng氣qi，判pan定ding加jia熱re絲si可ke能neng燒shao壞huai了le，可ke拿na萬wan用yong表biao量liang一yi下xia加jia熱re絲si正zheng負fu極ji，不bu通tong可ke確que定ding加jia熱re絲si損sun壞huai，換huan新xin加jia熱re絲si。
如果機器不能正常加堿，開機後又沒有任何聲音，判斷是保險絲燒斷了，保險管位置在機器內部靠近電源開關接口5公分處黑色殼子內。
6、 凱氏定氮儀工作時聲音大，是否正常？
答：屬於正常現象，這是機器內部氣泵工作的聲音。
7、 凱氏定氮儀工作中不能加堿、加堿沒有聲音，為什麼？
答：檢查堿桶是否漏氣，被氣充鼓機器才能正常工作；儀器使用時間過長，堿管內部會產生結晶，導致加液時流速降低，沒有聲音。
8、 定氮儀在工作時，從頂部冒出類似煙的氣體，怎麼回事？
答：檢(jian)查(zha)冷(leng)卻(que)水(shui)進(jin)水(shui)的(de)水(shui)龍(long)頭(tou)是(shi)否(fou)打(da)開(kai)，冷(leng)卻(que)水(shui)關(guan)閉(bi)或(huo)者(zhe)水(shui)量(liang)小(xiao)都(dou)會(hui)導(dao)致(zhi)消(xiao)化(hua)管(guan)出(chu)來(lai)的(de)蒸(zheng)氣(qi)不(bu)能(neng)被(bei)冷(leng)凝(ning)，從(cong)機(ji)器(qi)裏(li)冒(mao)出(chu)來(lai)的(de)水(shui)蒸(zheng)氣(qi)，看(kan)起(qi)來(lai)類(lei)似(si)煙(yan)。
9、 定氮儀使用中發現消化管進滿水，怎麼解決？
答：定氮儀使用中發生消化管進滿水，是由於機器控製水位器導電性降低造成的，解決辦法：打開水位器取出探針用砂紙打磨，去掉氧化層；在蒸餾水桶裏加入3-5克實驗室用氯化鈉，搖勻溶解。
10、定氮儀使用中發生蒸餾器、水位器進滿水，硼酸吸收液容器中進水，怎麼解決？
答：是機器控製水位器導電性降低造成的，解決辦法：打開水位器取出探針用砂紙打磨，去掉氧化層；在蒸餾水桶裏加入3-5克實驗室用氯化鈉，搖勻溶解。
11、定氮儀使用中消化管中白色管子發生倒吸，怎樣解決？
答: 儀器停止工作（蒸餾器停止加熱），氣閥未能及時關閉，會產生倒吸現象，可在白色管子上紮一些小孔。氣閥損壞，不能關閉，也會倒吸。
12、定氮儀工作中隔3-5秒鍾會發出聲響，是否正常？
答：這種聲響屬於正常現象，儀器工作狀態下，蒸餾器會不斷加熱產生水蒸汽而消耗水，儀器會自動打開水閥進行補水，聲響就是水閥打開、關閉的聲音，屬於正常現象。
注：
1、每次使用儀器前，應讓儀器空煮一次，清洗儀器的內部管路。
2、儀器使用完畢，應將其中一隻桶的桶蓋打開，將桶內的氣體排出，延長附件的使用壽命（3個或2個桶串聯，排氣時隻打開一隻桶蓋即可）。
