細胞培養是細胞生物學研究方法中最常用也是最重要的技術之一，在現代醫學

、生物科學、農nong業ye科ke學xue等deng領ling域yu被bei廣guang泛fan應ying用yong以yi提ti供gong研yan究jiu模mo型xing和he實shi驗yan材cai料liao。在zai細xi胞bao培pei養yang過guo程cheng中zhong，完wan全quan培pei養yang基ji對dui細xi胞bao生sheng長chang狀zhuang態tai起qi到dao關guan鍵jian作zuo用yong
，決jue定ding實shi驗yan成cheng功gong與yu否fou。而er血xue清qing是shi完wan全quan培pei養yang基ji中zhong的de關guan鍵jian成cheng分fen之zhi一yi
，除chu為wei細xi胞bao生sheng長chang提ti供gong基ji本ben營ying養yang物wu質zhi
、結合蛋白、一yi些xie參can與yu解jie毒du代dai謝xie的de微wei量liang元yuan素su和he可ke起qi到dao中zhong和he保bao護hu的de酶mei類lei之zhi外wai，還hai可ke以yi保bao護hu細xi胞bao免mian受shou機ji械xie損sun傷shang
，因yin此ci被bei業ye內nei認ren為wei是shi細xi胞bao增zeng殖zhi過guo程cheng中zhong最zui重zhong要yao的de試shi劑ji。在zai生sheng命ming科ke學xue領ling域yu的de細xi胞bao培pei養yang技ji術shu中zhong，動dong物wu血xue清qing的de應ying用yong十shi分fen廣guang泛fan，特te別bie是shi牛niu來lai源yuan血xue清qing。而er牛niu源yuan血xue清qing又you分fen為wei胎tai牛niu血xue清qing
、新生牛血清和小牛血清，它們的區別方式主要由於牛齡和采血方式不同，其中胎牛血清因其抗體水平含量低對後續實驗結果影響小、生長因子含量水平高利於細胞增殖而應用最廣。因此關注胎牛血清的品級、質量以及使用過程的一些注意事項
，會對實驗結果起到直接影響作用，並可以確保科研人員在實驗操作過程中的安全性。

今天我們就來看看在細胞培養過程中血清使用方麵常見的問題
，如：血清儲存條件、如何程序解凍、細胞汙染與血清之間的關係、傳說中的“黑膠蟲”是什麼以及血清熱滅活是否有必要等等，“工欲善其事，必先利其器”，通過今天的解析與學習可以讓我們在做細胞培養相關實驗時事半功倍！那我們就開始吧~

Q1：血清長期儲存的條件和方法是什麼？

A1：血清如需長期保存，則必須儲存於-10℃或更低溫冰箱中
，建議存放於-20℃的冰箱中。研究表明儲存在-80℃條件下的血清在性能方麵變化不大，但由於解凍時溫差過大
，會導致析出更多沉澱，使得背景雜亂，因此血清長期保存不建議處於-80℃條件下。如果近期會頻繁使用血清，我們建議不要在4℃條件下存放超過1個月，若一次無法用完整瓶建議分裝後保存，且要避免反複凍融。另外，血清冰凍後體積會增加約10%，因此血清分裝時請留意預留一定的體積空間。

Q2：如何進行血清的程序性解凍？血清才不會使產品質量受損
？

A2：chengxuxingjiedongxueqingkeyiquebaoxueqingzhipinzhiliangdewendingxing，qiebuhuiyinweiwenchaguodaerxichuguoduodanbaidengchendian。chengxuxingjiedongfangfashiyushiyankaishizhiqianjianglengdongdexueqingzhiyu4℃冰箱中融解
，並且在解凍過程中每隔1小時搖勻一次，使溫度與成分均一，減少沉澱析出，直至全部解凍
，然後再移入室溫條件下使用。

Q3：血清解凍後發現絮狀沉澱該如何處理？

A3：造zao成cheng血xue清qing發fa生sheng絮xu狀zhuang沉chen澱dian的de原yuan因yin主zhu要yao是shi血xue清qing解jie凍dong過guo程cheng中zhong溫wen差cha帶dai來lai了le脂zhi蛋dan白bai變bian性xing和he纖xian維wei蛋dan白bai析xi出chu
，沉chen澱dian本ben身shen不bu會hui影ying響xiang血xue清qing質zhi量liang，也ye不bu會hui對dui實shi驗yan結jie果guo造zao成cheng影ying響xiang。但dan如ru必bi須xu處chu理li沉chen澱dian
，則ze可ke通tong過guo離li心xin方fang式shi去qu除chu
，如ru500-1000×g離心5-10 min。

Q4：血清沉澱是什麼？

A4：yongyuxibaopeiyangdetainiuxueqingjiqitaxueleizhipinzhongjuncunzaigezhongleixingdechendian
，ruxianweidanbaihelinsuangaideng。yixiexuzhuangchendianzhuyaojiushixianweidanbai
，tongchangwomenrouyankejian
，daxiaozai1-2mm之間；而磷酸鈣在顯微鏡下觀察呈現布朗運動的小黑點，通常被誤認為是微生物汙染。血清沉澱往往比較難以預測和控製，但幸運的是這些沉澱不會影響血清品質。

Q5：血清中的小黑點是“黑膠蟲”麼
？

A5：血清解凍過程溫差過大

、經反複凍融或通過熱滅活處理後更容易產生沉澱，這些沉澱物在鏡下觀察時有一些會呈現以布朗運動的小黑點，業內流行一種“黑膠蟲”汙染的說法，但“黑膠蟲”一直以來都是極為神秘的存在，至今科學家們也沒有完整的實驗結果可以證實它究竟是一種生物還是非生物，更有人認為“黑膠蟲”是(shi)血(xue)清(qing)的(de)原(yuan)蟲(chong)
，或(huo)誤(wu)以(yi)為(wei)是(shi)細(xi)菌(jun)或(huo)真(zhen)菌(jun)汙(wu)染(ran)。但(dan)科(ke)學(xue)家(jia)通(tong)過(guo)進(jin)一(yi)步(bu)的(de)研(yan)究(jiu)發(fa)現(xian)它(ta)們(men)更(geng)可(ke)能(neng)是(shi)血(xue)清(qing)中(zhong)的(de)蛋(dan)白(bai)結(jie)晶(jing)。這(zhe)種(zhong)結(jie)晶(jing)可(ke)能(neng)為(wei)蛋(dan)白(bai)析(xi)出(chu)，如(ru)纖(xian)維(wei)蛋(dan)白(bai)原(yuan)凝(ning)結(jie)成(cheng)纖(xian)維(wei)蛋(dan)白(bai)；或是鹽析出
，如磷酸鈣等
；也有一些是膽固醇和脂肪酸。以下圖片就證實了這一說法，如纖維蛋白和磷酸鈣。

圖1：上圖分別為纖維蛋白在低倍鏡和高倍鏡下觀察到的圖像，下圖為磷酸鈣在低倍鏡和高倍鏡下觀察到的圖像（箭頭指示的是我們看到的“黑點”）

Q6：如何判斷血清汙染？

A6：

（1）首先檢查並判斷外包裝是否有破損，一般瓶身破損的血清發生汙染的可能性極大；

（2）將血清接種到血酯板上，培養後看是否有菌落形成

；

（3）可通過質量檢測試劑盒檢測結果判定，如支原體檢測試劑盒等。血清汙染主要包括細菌汙染、真菌汙染和支原體汙染。在細胞培養時想要確定血清存在細菌汙染，可嚐試使用5-10倍濃度青鏈黴素雙抗衝擊培養24-48h；真菌汙染的細胞無法搶救，應立即將細胞瓶進行高壓滅菌處理，並徹底消毒培養箱；支原體汙染可考慮更換早期代次細胞，或使用商品化支原體去除試劑。

Q7：細胞形態不正常、生長狀態異常或增殖速率緩慢是否與血清有關
？

A7：細胞形態異常需要綜合關注細胞代次、傳代操作、培pei養yang基ji和he血xue清qing等deng諸zhu多duo因yin素su。如ru傳chuan代dai次ci數shu過guo多duo或huo傳chuan代dai時shi間jian過guo晚wan都dou有you可ke能neng影ying響xiang細xi胞bao的de生sheng長chang狀zhuang態tai。有you些xie細xi胞bao對dui血xue清qing具ju有you一yi定ding適shi應ying性xing
，更geng換huan新xin批pi次ci血xue清qing時shi可ke能neng出chu現xian所suo含han因yin子zi水shui平ping的de差cha異yi而er導dao致zhi的de細xi胞bao生sheng長chang狀zhuang態tai受shou到dao影ying響xiang的de現xian象xiang，可ke以yi通tong過guo血xue清qing梯ti度du替ti換huan或huo者zhe增zeng加jia細xi胞bao適shi應ying時shi間jian來lai解jie決jue此ci類lei問wen題ti。與yu此ci同tong時shi也ye要yao關guan注zhu基ji礎chu培pei養yang基ji和he傳chuan代dai操cao作zuo等deng方fang麵mian是shi否fou存cun在zai一yi定ding問wen題ti。

Q8：如何做血清的梯度替換？

A8：當dang細xi胞bao培pei養yang實shi驗yan需xu更geng換huan血xue清qing品pin牌pai時shi，做zuo程cheng序xu性xing梯ti度du替ti換huan方fang案an尤you為wei重zhong要yao，因yin為wei不bu同tong品pin牌pai的de血xue清qing所suo含han成cheng分fen有you所suo差cha異yi，血xue清qing更geng換huan會hui使shi細xi胞bao發fa生sheng不bu適shi
，從cong而er出chu現xian細xi胞bao增zeng殖zhi緩huan慢man或huo細xi胞bao狀zhuang態tai不bu佳jia等deng情qing況kuang。建jian議yi的de梯ti度du替ti換huan方fang法fa為wei：完全培養基配置過程中先用25%新血清與75%原血清進行混合，培養傳代1-2次；而後用50%新血清與50%原血清混合培養傳代；再用75%新血清與25%原血清混合培養傳代
；最後完全使用新血清培養傳代。

Q9：培養基中添加血清和抗生素後可長期保存嗎?

A9：新鮮培養基中添加血清和抗生素後，建議在2周內使用完。

Q10：血清的熱滅活是必須的嗎?

A10：shiyanbiaoming，jingremiehuochulidexueqingduixibaoshengchangkenengjinyouweixiaocujinhuowanquanmeiyourenhezuoyong，shenzhitongchangyingaowenchuliersunshidiaoxueqingzhongbufenyingyangchengfencongeryingxiangxueqingzhiliang
，zaochengxibaoshengchangsulvjiangdi。remiehuoguochengzhongyinjubuwenduguogao、yaohuangbujunyunhuomiehuoshijianguochang，douhuizaochengxueqingpinzhixiajiang，qiejingremiehuohoudexueqinghuizengjiafashengdanbaichendiangailv。yinci，ruofeibixuxueqingbuxuyaozuoremiehuo，ershaoshuduibutimingandexibaoshiyan，rumouxiemianyixueshiyanhuoxianbingdubaozhuangdeng

，kezhuoqingduixueqingjinxingremiehuocaozuo。

Q11：血清熱滅活應如何操作？

A11：

1.熱滅活前，必須先將解凍後的血清搖勻
，並恢複至室溫；

2.取部分搖勻血清置於50ml離心管中
，並準備同規格對照管一個；

3.對照管內加入血清等體積水；

4.對照管內插入溫度計進行溫度預試
，當溫度達到 56℃時將恢複至室溫的血清放入水浴鍋30min；

5.滅活過程中需要每隔5min輕輕晃動搖勻，以保證溫度均一。

Q12：血清為什麼存在批間差？

A12：血清批間差是客觀存在的，因為血清製品來源於天然活體，供體牛隻的生理狀況、健康狀況均不同，且受飼養環境的地形、風貌
、飲食
、水源等影響，體內各類蛋白、生(sheng)長(chang)因(yin)子(zi)和(he)酶(mei)類(lei)的(de)含(han)量(liang)均(jun)有(you)巨(ju)大(da)差(cha)異(yi)，所(suo)以(yi)血(xue)清(qing)具(ju)有(you)含(han)量(liang)複(fu)雜(za)且(qie)不(bu)固(gu)定(ding)的(de)特(te)性(xing)，批(pi)間(jian)差(cha)異(yi)在(zai)所(suo)難(nan)免(mian)，因(yin)此(ci)批(pi)間(jian)差(cha)異(yi)小(xiao)的(de)血(xue)清(qing)不(bu)僅(jin)可(ke)以(yi)保(bao)證(zheng)血(xue)清(qing)質(zhi)量(liang)
，確(que)保(bao)細(xi)胞(bao)培(pei)養(yang)效(xiao)果(guo)，還(hai)能(neng)減(jian)少(shao)由(you)於(yu)批(pi)間(jian)差(cha)異(yi)帶(dai)來(lai)的(de)使(shi)用(yong)前(qian)測(ce)試(shi)，且(qie)避(bi)免(mian)實(shi)驗(yan)結(jie)果(guo)的(de)不(bu)可(ke)重(zhong)複(fu)性(xing)。