其qi實shi我wo們men一yi般ban微wei生sheng物wu實shi驗yan室shi自zi己ji還hai是shi可ke以yi做zuo一yi些xie工gong作zuo

，特te別bie是shi細xi菌jun的de鑒jian定ding。再zai就jiu是shi菌jun種zhong鑒jian定ding時shi，不bu是shi直zhi接jie拿na來lai就jiu鑒jian定ding，需xu要yao一yi些xie預yu先xian做zuo一yi些xie處chu理li或huo判pan斷duan。現xian將jiang一yi些xie基ji礎chu知zhi識shi進jin行xing總zong結jie如ru下xia：

一、相關定義

1、生理生化鑒定：根據微生物對各種生理條件（溫度
、pH
、氧氣、滲透壓）、生化指標（唯1碳氮源、抗生素
、酶、鹽堿性）代(dai)謝(xie)反(fan)應(ying)進(jin)行(xing)分(fen)析(xi)，並(bing)將(jiang)結(jie)果(guo)轉(zhuan)化(hua)成(cheng)軟(ruan)件(jian)可(ke)以(yi)識(shi)別(bie)的(de)數(shu)據(ju)，進(jin)行(xing)聚(ju)類(lei)分(fen)析(xi)，與(yu)已(yi)知(zhi)的(de)參(can)比(bi)菌(jun)株(zhu)數(shu)據(ju)庫(ku)進(jin)行(xing)比(bi)較(jiao)，最(zui)終(zhong)對(dui)未(wei)知(zhi)菌(jun)進(jin)行(xing)鑒(jian)定(ding)的(de)一(yi)種(zhong)技(ji)術(shu)。

2、革蘭氏染色：係細菌學中廣泛使用的一種鑒別染色法
，染色後細菌與環境形成鮮明對比
，可以清楚地觀察到細菌的形態、排列及某些結構特征，而用以分類鑒定。

3

、平板劃線法：係指把雜菌樣品通過在平板表麵劃線稀釋而獲得單菌落的方法。

4

、氧化酶試驗：氧化酶不直接與氧化酶試劑起反應，而是先使細胞-色素C氧化，然後此氧化型細胞-色素C再使對苯二胺氧化
，產生顏色反應而進行的試驗，用於區分不發酵的革蘭陰性杆菌（氧化酶陽性）和腸道菌（氧化酶陰性）。

5

、觸酶試驗：大多需氧和兼性厭氧菌均產生過氧化氫酶，但鏈球菌屬陰性，故常用此試驗來鑒定，用於區分葡萄球菌(過氧化氫酶陽性）和鏈球菌(過氧化氫酶陰性）。

6、凝固酶試驗：用於區分凝固酶陰性葡萄球菌（可推測為非致病性）和凝固酶陽性葡萄球菌(很可能為致病性）。

二
、工作程序

1、微生物鑒定程序

微(wei)生(sheng)物(wu)鑒(jian)定(ding)的(de)基(ji)本(ben)程(cheng)序(xu)包(bao)括(kuo)分(fen)離(li)純(chun)化(hua)和(he)鑒(jian)定(ding)
，鑒(jian)定(ding)時(shi)一(yi)般(ban)先(xian)將(jiang)待(dai)檢(jian)菌(jun)進(jin)行(xing)初(chu)步(bu)的(de)分(fen)類(lei)。鑒(jian)定(ding)的(de)方(fang)法(fa)有(you)表(biao)型(xing)微(wei)生(sheng)物(wu)鑒(jian)定(ding)和(he)基(ji)因(yin)型(xing)微(wei)生(sheng)物(wu)鑒(jian)定(ding)

，根(gen)據(ju)所(suo)需(xu)要(yao)達(da)到(dao)的(de)鑒(jian)定(ding)水(shui)平(ping)選(xuan)擇(ze)鑒(jian)定(ding)方(fang)法(fa)。目(mu)前(qian)實(shi)驗(yan)室(shi)室(shi)進(jin)行(xing)表(biao)型(xing)微(wei)生(sheng)物(wu)鑒(jian)定(ding)後(hou)可(ke)以(yi)用(yong)API試劑條進行或其他等效的試劑條進行菌種鑒定，如API試劑條鑒定不能滿足要求時采取委外鑒定。

注：為了控製成本，可以自己進行鑒定，不具備能力時再委外。API鑒定用的試劑條的效期有限，需要注意效期或跟供應商做好溝通備貨。

1.1 待檢菌的分離與純化

微生物鑒定的第一步是待檢培養物的分離純化，最chang用的分離純化方法是挑去待檢菌的純培養物（單個菌落），必要時可進一步進行純培養
，為表型鑒定和隨後的鑒定程序提供足夠量的菌體。從藥物原材料、製藥用水
、生產環境、zhongjianchanpinhezuizhongchanpindeyangpinzhongjianchudeshousunweishengwu，jingfenlichunhuachengxushiqiyoubulishengcunyichanshengbianhuadezhuangtaibianweizaiyingyangfujihezuijiapeiyangwendutiaojianxiashengcundewendingzhuangtai，yibaozhengjiandingjieguodezhunquexing，jutixiangjianbiao1。

表1待檢菌的分離與純化明細表

1.1.1 平板劃線法

平板劃線方法一般通過連續畫蛇形曲線或四區劃線方法進行。四區劃線具體步驟如下：先在平皿上做好標識，然後在選擇所獲得的新鮮菌種進行劃線；左手持無菌平板
，拇指和食指控製皿蓋，其餘指控製皿底，打開皿蓋
，用接種環在皿上進行劃線
，一區要連續緊密的幾根平行線（如果菌量過多可以更換接種環）
，二區緊著著一區的最後一根線帶出來
，劃幾根平行線，然後三區

、四區同樣的操作，四區應盡量避免接觸到菌落密集區，影響單菌落的形成；最後再選擇適宜的溫度進行培養。

1.1 .2 稀釋倒平板法

首先把微生物懸液作一係列的稀釋（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然後分別取不同稀釋液少許，與已熔化並冷卻至50℃左(zuo)右(you)的(de)瓊(qiong)脂(zhi)培(pei)養(yang)基(ji)混(hun)合(he)，搖(yao)勻(yun)後(hou)，傾(qing)入(ru)滅(mie)過(guo)菌(jun)的(de)培(pei)養(yang)皿(min)中(zhong)，待(dai)瓊(qiong)脂(zhi)凝(ning)固(gu)後(hou)
，製(zhi)成(cheng)可(ke)能(neng)含(han)菌(jun)的(de)瓊(qiong)脂(zhi)平(ping)板(ban)，保(bao)溫(wen)培(pei)養(yang)一(yi)定(ding)時(shi)間(jian)即(ji)可(ke)出(chu)現(xian)菌(jun)落(luo)。

如ru果guo稀xi釋shi得de當dang，在zai平ping板ban表biao麵mian或huo瓊qiong脂zhi培pei養yang基ji中zhong就jiu可ke出chu現xian分fen散san的de單dan個ge菌jun落luo，這zhe個ge菌jun落luo可ke能neng就jiu是shi由you一yi個ge細xi菌jun細xi胞bao繁fan殖zhi形xing成cheng的de。隨sui後hou挑tiao取qu該gai單dan個ge菌jun落luo
，或huo重zhong複fu以yi上shang操cao作zuo數shu次ci



，便bian可ke得de到dao純chun培pei養yang。

1.1.3 塗布平板法

yinweijiangweishengwuxuanyexianjiadaojiaotangdepeiyangjizhongzaidaopingbanyizaochengmouxiereminganjundesiwang，qiecaiyongxishidaopingbanfayehuishiyixieyangehaoyangjunyinbeigudingzaiqiongzhizhongjianquefayangqieryingxiangqishengchang
，yincizaiweishengwuxueyanjiuzhongchangyongdechunzhongfenlifangfashitubupingbanfa。

qizuofashixianjiangyironghuadepeiyangjidaoruwujunpingmin，zhichengwujunpingban，lengqueningguhou，jiangyidingliangdeweishengwuxuanyedijiazaipingbanbiaomian
，zaiyongwujunbolitubangjiangjunyejunyunfensanzhizhenggepingbanbiaomian

，jingpeiyanghoutiaoqudangejunluo。

1.2 初篩實驗

常規的微生物鑒定，一般要先進行初篩試驗確定待檢菌的基本微生物特征，將待檢菌進行初步分類。常見的初篩試驗包括革蘭氏染色、芽孢染色、鏡檢觀察染色結果和細胞形態、重要的生化反應等。

1.2.1 革蘭氏染色

原理：檢查細菌細胞壁的滲透性，染色前所有細胞是透明的，結晶紫著色後用碘增加染料與菌體結合，乙醇從G(-)菌體洗脫結晶紫，用番紅液複染
，革蘭氏陰性菌呈粉紅色，革蘭氏陽性菌呈藍紫色。

染色步驟：一yi般ban按an照zhao染ran色se液ye說shuo明ming書shu規gui定ding進jin行xing染ran色se，如ru說shuo明ming書shu無wu明ming確que說shuo明ming時shi按an以yi下xia步bu驟zhou進jin行xing染ran色se。結jie晶jing紫zi初chu染ran，在zai載zai玻bo片pian上shang滴di一yi小xiao滴di純chun化hua水shui，用yong灼zhuo燒shao過guo的de接jie種zhong針zhen挑tiao取qu少shao量liang細xi菌jun，置zhi載zai玻bo片pian的de水shui滴di中zhong與yu水shui混hun合he並bing塗tu抹mo開kai

，塗tu抹mo要yao均jun勻yun平ping坦tan
，塗tu抹mo後hou直zhi徑jing約yue為wei1 cm的薄層。

將(jiang)載(zai)玻(bo)片(pian)在(zai)火(huo)焰(yan)上(shang)方(fang)快(kuai)速(su)來(lai)回(hui)通(tong)過(guo)一(yi)兩(liang)次(ci)，以(yi)載(zai)玻(bo)片(pian)的(de)加(jia)熱(re)麵(mian)接(jie)觸(chu)手(shou)背(bei)皮(pi)膚(fu)
，不(bu)覺(jiao)過(guo)燙(tang)為(wei)佳(jia)，待(dai)冷(leng)卻(que)後(hou)再(zai)在(zai)火(huo)焰(yan)上(shang)方(fang)來(lai)回(hui)通(tong)過(guo)一(yi)兩(liang)次(ci)
，再(zai)冷(leng)卻(que)
，重(zhong)複(fu)操(cao)作(zuo)直(zhi)到(dao)薄(bo)層(ceng)幹(gan)燥(zao)為(wei)止(zhi)；在製好的片上滴一滴草酸銨結晶紫，染色1 min後用水洗

；碘液媒染
，加碘液一滴，作用1 min後用水衝洗，用過濾紙吸幹；乙醇脫色，用95%乙醇脫色，脫色時間大概為30 s。水洗後用過濾紙吸幹；番紅複染，滴加0.5%的番紅染色液一滴，染色10～30 s後，用自來水衝洗。

鏡檢：先低倍鏡，再高倍鏡，最後油鏡觀察
，觀察菌落形態與菌落顏色，菌落呈紅色即革蘭氏陰性菌，呈藍紫色為革蘭氏陽性菌。

1.2.2 芽孢染色

一(yi)般(ban)按(an)照(zhao)染(ran)色(se)液(ye)使(shi)用(yong)說(shuo)明(ming)進(jin)行(xing)芽(ya)孢(bao)染(ran)色(se)。如(ru)無(wu)明(ming)確(que)說(shuo)明(ming)時(shi)按(an)以(yi)下(xia)步(bu)驟(zhou)進(jin)行(xing)芽(ya)孢(bao)染(ran)色(se)。塗(tu)片(pian)


，先(xian)在(zai)載(zai)玻(bo)片(pian)上(shang)滴(di)一(yi)滴(di)純(chun)化(hua)水(shui)，用(yong)接(jie)種(zhong)環(huan)灼(zhuo)燒(shao)過(guo)的(de)接(jie)種(zhong)針(zhen)挑(tiao)取(qu)少(shao)量(liang)細(xi)菌(jun)

，置(zhi)載(zai)玻(bo)片(pian)的(de)水(shui)滴(di)中(zhong)與(yu)水(shui)混(hun)合(he)並(bing)塗(tu)抹(mo)開(kai)，塗(tu)抹(mo)要(yao)均(jun)勻(yun)平(ping)坦(tan)，塗(tu)抹(mo)後(hou)直(zhi)徑(jing)約(yue)為(wei)1 cm的薄層。

幹燥固定，將(jiang)載(zai)玻(bo)片(pian)在(zai)火(huo)焰(yan)上(shang)方(fang)快(kuai)速(su)來(lai)回(hui)通(tong)過(guo)一(yi)兩(liang)次(ci)，以(yi)載(zai)玻(bo)片(pian)的(de)加(jia)熱(re)麵(mian)接(jie)觸(chu)手(shou)背(bei)皮(pi)膚(fu)，不(bu)覺(jiao)過(guo)燙(tang)為(wei)佳(jia)，待(dai)冷(leng)卻(que)後(hou)再(zai)在(zai)火(huo)焰(yan)上(shang)方(fang)來(lai)回(hui)通(tong)過(guo)一(yi)兩(liang)次(ci)，再(zai)冷(leng)卻(que)，重(zhong)複(fu)操(cao)作(zuo)直(zhi)到(dao)薄(bo)層(ceng)幹(gan)燥(zao)為(wei)止(zhi)。孔雀綠覆蓋，用木夾夾住載玻片一端，加數滴5%孔雀綠染液覆蓋塗片，在微火上加熱至染料冒蒸汽並開始計時
，維持5min。

衝洗，待玻片冷卻後，用緩流自來水衝洗載玻片背麵，直至流出的水無色為止。複染

，用0.5%番紅染液覆蓋玻片，保持3min。  水洗幹燥，用緩流自來水衝洗載玻片背麵，直至流出的水無色為止，使其自然幹燥。鏡檢，觀察菌落是否含有芽孢。

1.2.3 氧化酶試驗（革蘭氏陰性杆菌）

革蘭氏陰性菌，做氧化酶試驗。取將待檢菌落於無菌的濾紙片上，滴加一滴氧化酶試劑
，反應3分鍾，出現紫色為陽性，反之為陰性。

1.2.4 非發酵菌鑒定

接種前把OF培養基在沸水浴溶解
，在室溫冷卻後,每試驗分裝 2個安培的固體OF培養基，利用接種針挑單個菌落,穿刺到OF培養基(深度約1cm.)，把其中一個已接種好的安培(OF.F),用石蠟油覆蓋1cm. 把兩個安培蓋上塑料帽,培養35-37°C , 24 – 48小時。

結果判定：兩瓶均為黃色，則為發酵菌，則為發酵菌，兩管培養基一瓶顯示綠色F-，一瓶顯示黃色O+。

1.2.5 觸酶試驗（革蘭氏陽性菌）

玻片法：挑取被撿菌落於玻片上

，直接用試劑進行乳化，5s內產生氣泡即為陽性結果，反之為陰性。

1.3 表型微生物鑒定

表(biao)型(xing)微(wei)生(sheng)物(wu)鑒(jian)定(ding)依(yi)據(ju)表(biao)型(xing)特(te)征(zheng)的(de)表(biao)達(da)來(lai)區(qu)分(fen)不(bu)同(tong)微(wei)生(sheng)物(wu)間(jian)的(de)差(cha)異(yi)，是(shi)經(jing)典(dian)的(de)微(wei)生(sheng)物(wu)分(fen)類(lei)鑒(jian)定(ding)法(fa)，以(yi)微(wei)生(sheng)物(wu)細(xi)胞(bao)的(de)形(xing)態(tai)和(he)習(xi)性(xing)表(biao)型(xing)為(wei)主(zhu)要(yao)指(zhi)標(biao)，通(tong)過(guo)比(bi)較(jiao)微(wei)生(sheng)物(wu)的(de)菌(jun)落(luo)形(xing)態(tai)、理化特征和特征化學成分與典型微生物的差異進行鑒別。微生物分類中使用的表型特征如表2。

表2 微生物分類中使用的表性特征表