qishiwomenyibanweishengwushiyanshizijihaishikeyizuoyixiegongzuo，tebieshixijundejianding。zaijiushijunzhongjiandingshi
，bushizhijienalaijiujianding，xuyaoyixieyuxianzuoyixiechulihuopanduan。xianjiangyixiejichuzhishijinxingzongjieruxia：

一

、相關定義

1
、生理生化鑒定：根據微生物對各種生理條件（溫度
、pH、氧氣、滲透壓）
、生化指標（唯一碳氮源、抗生素

、酶、鹽堿性）代dai謝xie反fan應ying進jin行xing分fen析xi，並bing將jiang結jie果guo轉zhuan化hua成cheng軟ruan件jian可ke以yi識shi別bie的de數shu據ju，進jin行xing聚ju類lei分fen析xi，與yu已yi知zhi的de參can比bi菌jun株zhu數shu據ju庫ku進jin行xing比bi較jiao，最zui終zhong對dui未wei知zhi菌jun進jin行xing鑒jian定ding的de一yi種zhong技ji術shu。

2、革蘭氏染色：係細菌學中廣泛使用的一種鑒別染色法，染色後細菌與環境形成鮮明對比，可以清楚地觀察到細菌的形態、排列及某些結構特征，而用以分類鑒定。

3、平板劃線法：係指把雜菌樣品通過在平板表麵劃線稀釋而獲得單菌落的方法。

4、氧化酶試驗：氧化酶不直接與氧化酶試劑起反應，而是先使細胞色素C氧化，然後此氧化型細胞色素C再使對苯二胺氧化，產生顏色反應而進行的試驗
，用於區分不發酵的革蘭陰性杆菌（氧化酶陽性）和腸道菌（氧化酶陰性）。

5、觸酶試驗：大多需氧和兼性厭氧菌均產生過氧化氫酶，但鏈球菌屬陰性
，故常用此試驗來鑒定，用於區分葡萄球菌(過氧化氫酶陽性）和鏈球菌(過氧化氫酶陰性）。

6、凝固酶試驗：用於區分凝固酶陰性葡萄球菌（可推測為非致病性）和凝固酶陽性葡萄球菌(很可能為致病性）。

二、工作程序

1、微生物鑒定程序

微wei生sheng物wu鑒jian定ding的de基ji本ben程cheng序xu包bao括kuo分fen離li純chun化hua和he鑒jian定ding，鑒jian定ding時shi一yi般ban先xian將jiang待dai檢jian菌jun進jin行xing初chu步bu的de分fen類lei。鑒jian定ding的de方fang法fa有you表biao型xing微wei生sheng物wu鑒jian定ding和he基ji因yin型xing微wei生sheng物wu鑒jian定ding，根gen據ju所suo需xu要yao達da到dao的de鑒jian定ding水shui平ping選xuan擇ze鑒jian定ding方fang法fa。目mu前qian實shi驗yan室shi室shi進jin行xing表biao型xing微wei生sheng物wu鑒jian定ding後hou可ke以yi用yongAPI試劑條進行或其他等效的試劑條進行菌種鑒定
，如API試劑條鑒定不能滿足要求時采取委外鑒定。

注：為了控製成本
，可以自己進行鑒定，不具備能力時再委外。API鑒定用的試劑條的效期有限
，需要注意效期或跟供應商做好溝通備貨。

1.1 待檢菌的分離與純化

微生物鑒定的第一步是待檢培養物的分離純化
，最常用的分離純化方法是挑去待檢菌的純培養物（單個菌落），必要時可進一步進行純培養，為表型鑒定和隨後的鑒定程序提供足夠量的菌體。從藥物原材料、製藥用水

、生產環境
、中(zhong)間(jian)產(chan)品(pin)和(he)最(zui)終(zhong)產(chan)品(pin)的(de)樣(yang)品(pin)中(zhong)檢(jian)出(chu)的(de)受(shou)損(sun)微(wei)生(sheng)物(wu)，經(jing)分(fen)離(li)純(chun)化(hua)程(cheng)序(xu)使(shi)其(qi)由(you)不(bu)利(li)生(sheng)存(cun)易(yi)產(chan)生(sheng)變(bian)化(hua)的(de)狀(zhuang)態(tai)變(bian)為(wei)在(zai)營(ying)養(yang)富(fu)集(ji)和(he)最(zui)佳(jia)培(pei)養(yang)溫(wen)度(du)條(tiao)件(jian)下(xia)生(sheng)存(cun)的(de)穩(wen)定(ding)狀(zhuang)態(tai)，以(yi)保(bao)證(zheng)鑒(jian)定(ding)結(jie)果(guo)的(de)準(zhun)確(que)性(xing)，具(ju)體(ti)詳(xiang)見(jian)表(biao)1。

表1待檢菌的分離與純化明細表

1.1.1 平板劃線法

平板劃線方法一般通過連續畫蛇形曲線或四區劃線方法進行。四區劃線具體步驟如下：先在平皿上做好標識

，然後在選擇所獲得的新鮮菌種進行劃線；左手持無菌平板，拇指和食指控製皿蓋，其餘指控製皿底，打開皿蓋，用接種環在皿上進行劃線，一區要連續緊密的幾根平行線（如果菌量過多可以更換接種環），二區緊著著一區的最後一根線帶出來
，劃幾根平行線，然後三區、四區同樣的操作

，四區應盡量避免接觸到菌落密集區，影響單菌落的形成；最後再選擇適宜的溫度進行培養。

1.1 .2 稀釋倒平板法

首先把微生物懸液作一係列的稀釋（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然後分別取不同稀釋液少許，與已熔化並冷卻至50℃zuoyoudeqiongzhipeiyangjihunhe，yaoyunhou，qingrumieguojundepeiyangminzhong，daiqiongzhiningguhou，zhichengkenenghanjundeqiongzhipingban
，baowenpeiyangyidingshijianjikechuxianjunluo。

ruguoxishidedang，zaipingbanbiaomianhuoqiongzhipeiyangjizhongjiukechuxianfensandedangejunluo
，zhegejunluokenengjiushiyouyigexijunxibaofanzhixingchengde。suihoutiaoqugaidangejunluo，huozhongfuyishangcaozuoshuci
，biankededaochunpeiyang。

1.1.3 塗布平板法

因(yin)為(wei)將(jiang)微(wei)生(sheng)物(wu)懸(xuan)液(ye)先(xian)加(jia)到(dao)較(jiao)燙(tang)的(de)培(pei)養(yang)基(ji)中(zhong)再(zai)倒(dao)平(ping)板(ban)易(yi)造(zao)成(cheng)某(mou)些(xie)熱(re)敏(min)感(gan)菌(jun)的(de)死(si)亡(wang)，且(qie)采(cai)用(yong)稀(xi)釋(shi)倒(dao)平(ping)板(ban)法(fa)也(ye)會(hui)使(shi)一(yi)些(xie)嚴(yan)格(ge)好(hao)氧(yang)菌(jun)因(yin)被(bei)固(gu)定(ding)在(zai)瓊(qiong)脂(zhi)中(zhong)間(jian)缺(que)乏(fa)氧(yang)氣(qi)而(er)影(ying)響(xiang)其(qi)生(sheng)長(chang)
，因(yin)此(ci)在(zai)微(wei)生(sheng)物(wu)學(xue)研(yan)究(jiu)中(zhong)常(chang)用(yong)的(de)純(chun)種(zhong)分(fen)離(li)方(fang)法(fa)是(shi)塗(tu)布(bu)平(ping)板(ban)法(fa)。

其qi做zuo法fa是shi先xian將jiang已yi熔rong化hua的de培pei養yang基ji倒dao入ru無wu菌jun平ping皿min
，製zhi成cheng無wu菌jun平ping板ban，冷leng卻que凝ning固gu後hou
，將jiang一yi定ding量liang的de微wei生sheng物wu懸xuan液ye滴di加jia在zai平ping板ban表biao麵mian，再zai用yong無wu菌jun玻bo璃li塗tu棒bang將jiang菌jun液ye均jun勻yun分fen散san至zhi整zheng個ge平ping板ban表biao麵mian，經jing培pei養yang後hou挑tiao取qu單dan個ge菌jun落luo。

1.2 初篩實驗

常規的微生物鑒定，一般要先進行初篩試驗確定待檢菌的基本微生物特征，將待檢菌進行初步分類。常見的初篩試驗包括革蘭氏染色
、芽孢染色、鏡檢觀察染色結果和細胞形態、重要的生化反應等。

1.2.1 革蘭氏染色

原理：檢查細菌細胞壁的滲透性，染色前所有細胞是透明的
，結晶紫著色後用碘增加染料與菌體結合
，乙醇從G(-)菌體洗脫結晶紫，用番紅液複染，革蘭氏陰性菌呈粉紅色，革蘭氏陽性菌呈藍紫色。

染色步驟：yibananzhaoranseyeshuomingshuguidingjinxingranse，rushuomingshuwumingqueshuomingshianyixiabuzhoujinxingranse。jiejingzichuran，zaizaibopianshangdiyixiaodichunhuashui
，yongzhuoshaoguodejiezhongzhentiaoqushaoliangxijun，zhizaibopiandeshuidizhongyushuihunhebingtumokai，tumoyaojunyunpingtan，tumohouzhijingyuewei1 cm的薄層。

jiangzaibopianzaihuoyanshangfangkuaisulaihuitongguoyiliangci，yizaibopiandejiaremianjiechushoubeipifu，bujiaoguotangweijia
，dailengquehouzaizaihuoyanshangfanglaihuitongguoyiliangci，zailengque
，zhongfucaozuozhidaobocengganzaoweizhi
；在製好的片上滴一滴草酸銨結晶紫，染色1 min後用水洗

；碘液媒染，加碘液一滴，作用1 min後用水衝洗，用過濾紙吸幹
；乙醇脫色，用95%乙醇脫色，脫色時間大概為30 s。水洗後用過濾紙吸幹；番紅複染
，滴加0.5%的番紅染色液一滴，染色10～30 s後，用自來水衝洗。

鏡檢：先低倍鏡，再高倍鏡，最後油鏡觀察
，觀察菌落形態與菌落顏色，菌落呈紅色即革蘭氏陰性菌
，呈藍紫色為革蘭氏陽性菌。

1.2.2 芽孢染色

yibananzhaoranseyeshiyongshuomingjinxingyabaoranse。ruwumingqueshuomingshianyixiabuzhoujinxingyabaoranse。tupian，xianzaizaibopianshangdiyidichunhuashui
，yongjiezhonghuanzhuoshaoguodejiezhongzhentiaoqushaoliangxijun，zhizaibopiandeshuidizhongyushuihunhebingtumokai，tumoyaojunyunpingtan，tumohouzhijingyuewei1 cm的薄層。

幹燥固定，jiangzaibopianzaihuoyanshangfangkuaisulaihuitongguoyiliangci，yizaibopiandejiaremianjiechushoubeipifu，bujiaoguotangweijia，dailengquehouzaizaihuoyanshangfanglaihuitongguoyiliangci
，zailengque，zhongfucaozuozhidaobocengganzaoweizhi。孔雀綠覆蓋，用木夾夾住載玻片一端
，加數滴5%孔雀綠染液覆蓋塗片，在微火上加熱至染料冒蒸汽並開始計時，維持5min。

衝洗，待玻片冷卻後
，用緩流自來水衝洗載玻片背麵，直至流出的水無色為止。複染，用0.5%番紅染液覆蓋玻片
，保持3min。  水洗幹燥，用緩流自來水衝洗載玻片背麵，直至流出的水無色為止
，使其自然幹燥。鏡檢，觀察菌落是否含有芽孢。

1.2.3 氧化酶試驗（革蘭氏陰性杆菌）

革蘭氏陰性菌，做氧化酶試驗。取將待檢菌落於無菌的濾紙片上
，滴加一滴氧化酶試劑，反應3分鍾
，出現紫色為陽性

，反之為陰性。

1.2.4 非發酵菌鑒定

接種前把OF培養基在沸水浴溶解
，在室溫冷卻後,每試驗分裝 2個安培的固體OF培養基，利用接種針挑單個菌落,穿刺到OF培養基(深度約1cm.)


，把其中一個已接種好的安培(OF.F),用石蠟油覆蓋1cm. 把兩個安培蓋上塑料帽,培養35-37°C , 24 – 48小時。

結果判定：兩瓶均為黃色
，則為發酵菌
，則為發酵菌，兩管培養基一瓶顯示綠色F-，一瓶顯示黃色O+。

1.2.5 觸酶試驗（革蘭氏陽性菌）

玻片法：挑取被撿菌落於玻片上，直接用試劑進行乳化，5s內產生氣泡即為陽性結果，反之為陰性。

1.3 表型微生物鑒定

表biao型xing微wei生sheng物wu鑒jian定ding依yi據ju表biao型xing特te征zheng的de表biao達da來lai區qu分fen不bu同tong微wei生sheng物wu間jian的de差cha異yi，是shi經jing典dian的de微wei生sheng物wu分fen類lei鑒jian定ding法fa，以yi微wei生sheng物wu細xi胞bao的de形xing態tai和he習xi性xing表biao型xing為wei主zhu要yao指zhi標biao
，通tong過guo比bi較jiao微wei生sheng物wu的de菌jun落luo形xing態tai
、理化特征和特征化學成分與典型微生物的差異進行鑒別。微生物分類中使用的表型特征如表2。

表2 微生物分類中使用的表性特征表

1.4.API試劑條的使用

1.4.1API試劑條的選條標準

根據API係統選條標準，來選擇適合的API鑒別條來鑒別。如革蘭氏陽性球菌：觸酶試驗陽性為葡萄球菌用API STAPH鑒別，觸酶試驗陰性為鏈球菌用API 20 STREP鑒別。

1.4.2API試劑條的操作步驟

1.4.2.1分離單個菌落：用一次性無菌接種環或已滅菌棉簽挑單個可疑菌落
，盡量避免使用高度選擇性培養基。

1.4.2.2安瓿瓶的開啟：蓋上安瓿開啟器，用手垂直握住安瓿瓶（白色塑料瓶蓋朝上），盡量將瓶蓋壓下，用大拇指頂住瓶蓋上斜麵部分，同時用拇指向外加壓。

1.4.2.3 製菌懸液：將挑取的單個菌落置於含0.85%氯化鈉溶液或懸浮培養基5ml的安培瓶，混勻。

1.4.2.4測定菌懸液濁度：

1.4.2.5菌液的加入：將5ml無菌水放入培養盒以提供濕潤的培養環境，同時放入試紙條

，將菌液接種到小管或小管及小杯(CIT, VP和 GEL)，利用石臘油覆蓋指定的生化孔 (有劃線的孔ADH
，ODC， H2S 和URE)
，蓋上培養蓋。

1.4.2.5培養：把試紙條放進培養箱內，利用指定溫度及時間進行培養（如API20E : 35 ~ 37℃，18-24 小時）。

1.4.2.6附加試劑加入：培養結束後，按操作說明書規定，將附加試劑加進適當小孔內。

1.4.2.7結果分析：登錄APIWEB,試紙條上每三個小孔（小管）作為一組，記分分別為1
、2、4分
，將試紙條的顯色情況進行輸入，進行結果對比判讀。

1.4.2.8結果判讀原理：

生化結果組合跟資料庫內的典型條目(Taxa)作出比較，經計算後，鑒定百比率（%Id）＝機會率，指示出不同菌類的比較，T值指示出在同一個菌類的相似程度。依據T值及%Id的組合
，作出評語：

極好的鑒定結果          %Id >99.9及T>0.75  
很好的鑒定結果          %Id >99.0及T>0.50  
好的鑒定結果              %Id >90.0及T>0.25  
可以接受的鑒定結果          %Id >80.0及T>0  
可疑的生化譜           N/A