所謂大腸菌群，是指在37℃培養24h 內能發酵乳糖產酸
、產氣的兼性厭氧的革藍氏陰性無芽孢杆菌的總稱。主要由腸杆菌科中四個屬內的細菌組成，即埃希氏杆菌屬
、檸檬酸杆菌屬
、克雷伯氏菌屬和腸杆菌屬。

水的大腸菌群數是指100 mL水檢樣內含有的大腸菌群實際數值，以大腸菌群最近似數(MPN)表示。在正常情況下，腸道中主要有大腸菌群、糞fen鏈lian球qiu菌jun和he厭yan氧yang芽ya孢bao杆gan菌jun等deng多duo種zhong細xi菌jun。這zhe些xie細xi菌jun都dou可ke以yi隨sui人ren畜chu排pai泄xie物wu進jin入ru水shui源yuan
，由you於yu大da腸chang菌jun群qun在zai腸chang道dao內nei數shu量liang多duo
，所suo以yi，水shui源yuan中zhong大da腸chang菌jun群qun的de數shu量liang，是shi直zhi接jie反fan映ying水shui源yuan被bei人ren畜chu排pai泄xie物wu汙wu染ran的de一yi項xiang重zhong要yao指zhi標biao。目mu前qian，國guo際ji上shang已yi公gong認ren大da腸chang菌jun群qun是shi糞fen便bian汙wu染ran的de指zhi標biao。因yin而er對dui飲yin用yong水shui必bi須xu進jin行xing大da腸chang菌jun群qun的de檢jian查zha。

水shui中zhong大da腸chang菌jun群qun的de檢jian測ce方fang法fa，常chang用yong多duo管guan發fa酵jiao法fa和he濾lv膜mo法fa。多duo管guan發fa酵jiao法fa可ke適shi用yong於yu各ge種zhong水shui樣yang的de檢jian驗yan，但dan操cao作zuo繁fan瑣suo，需xu要yao的de時shi間jian較jiao長chang。濾lv膜mo法fa僅jin適shi用yong於yu自zi來lai水shui和he深shen井jing水shui，操cao作zuo簡jian單dan、快速
，但不適用於雜質較多、易於堵塞濾孔的水樣。

材料與器皿

(—)培養基

1、普通乳糖蛋白腖培養液

蛋白腖 10g

，牛肉膏 3g，乳糖5g，氯化鈉 5g，1.6%溴甲酚紫乙醇液 1.0mL，蒸餾水 1000mL，pH 7.2~7.4。

將蛋白腖、牛肉膏、乳糖、氯化鈉加熱溶解於1000mL蒸餾水中
，調節pH為7.2~7.4，再加入1.6%溴甲酚紫乙醇液1.0mL，充分混勻，分裝於有杜漢氏小管的試管中
，每管10mL
，115℃滅菌20min。

2、三倍濃縮乳糖蛋白腖培養液

按上述普通乳糖蛋白腖培養液濃縮三倍配製，分裝於有杜漢氏小管的試管中


，每管5mL。

3、品紅亞硫酸鈉培養基(供平板分離用)

蛋白腖 10g， 乳糖 10g，K2HPO4 3.5g
，瓊脂 15-20g
，蒸餾水1000mL，無水亞硫酸鈉 5g

，5%的堿性品紅乙醇溶液 20mL
，pH 7.2~7.4。

4、伊紅美藍培養基(EMB培養基)(供發酵法平板分離用，3和4可任選一種)

蛋白腖10g
，乳糖10g，K2HPO4 2.0g，瓊脂20g
，蒸餾水1000mL，2%伊紅(曙紅)水溶液 20mL，5%美藍(亞甲藍)水溶液13mL，pH 7.2~7.4。

(二)滅菌移液管、滅菌稀釋水、試管、杜漢氏小管、革蘭氏染色液、滅菌培養皿。

實驗過程

(一)水樣的采集

供細菌學檢驗的水樣，必須按一般無菌操作的基本要求采集，並保證再運送、貯存過程中不受汙染。水樣從采集到檢驗不應超過4h ，在0-4℃下保存不應超過24h ，如不能在4h內分析，應在檢驗報告上注明保存時間和條件。

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、自來水取樣：應在水龍頭打開放水5min

，再用無菌容器接取水樣，待分析。如水樣內含有餘氯，則采樣瓶滅菌後按每500mL水樣加3% Na2S2O3.5H2O溶液1mL。

2、江、河、湖、池自然水體取樣：可用采樣器，采樣瓶應先滅菌。采樣後，瓶內應留有空隙。如果與其他化驗項目聯合取樣，細菌學分析水樣應采在其他樣品之前。

(二)初發酵試驗

1、水樣稀釋：製備水樣10-1
、10-2的稀釋液，方法為用無菌移液管吸取水樣10mL放於盛有90mL無菌水和若幹玻璃珠的錐形瓶中，充分振蕩使混合均勻

，並使其中的細菌盡量呈單個存在，即為10-1稀釋液;再從10-1製備10-2稀釋液。以此類推，稀釋到所需倍數。

2、接種和培養：以無菌操作於5支三倍濃縮培養基(接種前一定應先檢查杜漢氏小管內有無氣泡)中各加入水樣10mL，5支普通培養基試管中加入水樣1mL，5支普通培養基試管中加入10-1稀釋液1mL
，小心混勻放入37℃培養箱中培養24h。此即5管法。

3、結果觀察：37℃中培養24h後取出觀察，觀察有無氣體(杜漢氏小管內有無氣體)和酸產生(培養基有無變色)。在48h之間
，培養管內倒置的杜漢氏小管內有任何量的氣體積累

，或培養基顏色從紫色變為黃色，便可初步斷定為陽性反應。

若實驗所測定的15支管中均為陽性反應，說明濃水樣汙染嚴重，可將樣品進一步稀釋後，再按上述方法接種、培養和觀察。

(三)平板培養試驗

將jiang初chu發fa酵jiao實shi驗yan中zhong產chan酸suan產chan氣qi的de後hou隻zhi產chan酸suan或huo隻zhi產chan氣qi的de試shi管guan中zhong的de培pei養yang物wu用yong接jie種zhong環huan取qu少shao許xu，劃hua線xian接jie種zhong在zai品pin紅hong亞ya硫liu酸suan鈉na培pei養yang基ji或huo伊yi紅hong美mei藍lan培pei養yang基ji平ping板ban上shang，為wei了le確que保bao獲huo得de分fen離li的de單dan菌jun落luo，須xu注zhu意yi以yi下xia事shi項xiang：

(1)劃線間距至少相隔0.5厘米;

(2)接種釘尖端要稍彎;

(3)先對試管輕擊並使之傾斜
，以免接種針挑取到任何膜狀物或浮渣;

(4)劃線時要用針尖的彎曲部分接觸瓊脂培養基平麵.以免刮傷或戳破培養基。劃線後培養皿倒置

，於37℃培養18-24h。

24h後(hou)，觀(guan)察(cha)在(zai)平(ping)板(ban)上(shang)出(chu)現(xian)的(de)單(dan)個(ge)菌(jun)落(luo)，其(qi)核(he)心(xin)有(you)深(shen)綠(lv)色(se)金(jin)屬(shu)光(guang)澤(ze)者(zhe)為(wei)較(jiao)典(dian)型(xing)的(de)大(da)腸(chang)菌(jun)群(qun)菌(jun)落(luo)。盡(jin)可(ke)能(neng)挑(tiao)取(qu)典(dian)型(xing)的(de)或(huo)接(jie)近(jin)典(dian)型(xing)的(de)大(da)腸(chang)菌(jun)群(qun)菌(jun)落(luo)
，在(zai)營(ying)養(yang)瓊(qiong)脂(zhi)斜(xie)麵(mian)上(shang)劃(hua)線(xian)，置(zhi)37℃培養24h。挑取斜麵培養物製成塗片
，進行革蘭氏染色
，凡屬革蘭氏陰性杆菌
，即確認了大腸菌群細菌的存在.

(四)複發酵驗證實驗

經上述經染色為革蘭氏陰性的典型菌落，用接種環刮取部分接種於盛有乳糖培養基的試管中，在37℃培養24h
，陽性反應者即確認為大腸菌群細菌。

結果計算

在zai初chu發fa酵jiao試shi驗yan中zhong，可ke能neng有you極ji少shao數shu能neng發fa酵jiao乳ru糖tang產chan氣qi的de非fei大da腸chang菌jun群qun細xi菌jun混hun在zai陽yang性xing可ke疑yi反fan應ying管guan中zhong，通tong過guo對dui初chu發fa酵jiao中zhong的de陽yang性xing可ke疑yi管guan進jin行xing平ping板ban和he複fu發fa酵jiao試shi驗yan，並bing進jin行xing革ge蘭lan氏shi染ran色se和he細xi菌jun形xing態tai的de觀guan察cha
，可ke將jiang那na些xie少shao量liang的de非fei大da腸chang菌jun群qun細xi菌jun(“假陽性管”)刪除去，故在記錄時隻能把三步試驗都呈陽性的試管計入陽性反應管。

如果初發酵接種水樣量為10mL、1mL、0.1mL，可直接查表求出原水樣100mL中大腸菌群指數(MPN)。如果接種水樣量低於上述水樣量
，則經下麵的換算式計算。