有(you)些(xie)微(wei)生(sheng)物(wu)當(dang)遇(yu)到(dao)冷(leng)凍(dong)或(huo)幹(gan)燥(zao)等(deng)處(chu)理(li)時(shi)，會(hui)很(hen)快(kuai)死(si)亡(wang)
，因(yin)此(ci)在(zai)這(zhe)種(zhong)情(qing)況(kuang)下(xia)
，隻(zhi)能(neng)求(qiu)助(zhu)於(yu)傳(chuan)代(dai)培(pei)養(yang)保(bao)存(cun)法(fa)。傳(chuan)代(dai)培(pei)養(yang)就(jiu)是(shi)要(yao)定(ding)期(qi)地(di)進(jin)行(xing)菌(jun)種(zhong)轉(zhuan)接(jie)、培(pei)養(yang)後(hou)再(zai)保(bao)存(cun)
，它(ta)是(shi)最(zui)基(ji)本(ben)的(de)微(wei)生(sheng)物(wu)保(bao)存(cun)法(fa)，例(li)如(ru)酸(suan)奶(nai)等(deng)常(chang)用(yong)生(sheng)產(chan)菌(jun)種(zhong)的(de)保(bao)存(cun)。傳(chuan)代(dai)保(bao)存(cun)時(shi)
，培(pei)養(yang)基(ji)的(de)濃(nong)度(du)不(bu)宜(yi)過(guo)高(gao)，營(ying)養(yang)成(cheng)分(fen)不(bu)宜(yi)過(guo)於(yu)豐(feng)富(fu)，尤(you)其(qi)是(shi)碳(tan)水(shui)化(hua)合(he)物(wu)的(de)濃(nong)度(du)應(ying)在(zai)可(ke)能(neng)的(de)範(fan)圍(wei)內(nei)盡(jin)量(liang)降(jiang)低(di)。培(pei)養(yang)溫(wen)度(du)通(tong)常(chang)以(yi)稍(shao)低(di)於(yu)最(zui)適(shi)生(sheng)長(chang)溫(wen)度(du)為(wei)好(hao)。若(ruo)為(wei)產(chan)酸(suan)菌(jun)種(zhong)，則(ze)應(ying)在(zai)培(pei)養(yang)基(ji)中(zhong)添(tian)加(jia)少(shao)量(liang)碳(tan)酸(suan)鈣(gai)。　　

一般地，大多數菌種的保藏溫度以5℃為好，像厭氧菌、霍亂弧菌及部分病原真菌等微生物菌種則可以使用37℃進行保存，而蕈類等大型食用菌的菌種則可以室溫直接保存。傳代培養保存法雖然簡便
，但其缺點也很明顯，如：

①菌種管棉塞經常容易發黴;

②菌株的遺傳性狀容易發生變異;

③反複傳代時，菌株的病原性、形成生理活性物質的能力以及形成孢子的能力等均有降低;

④需要定期轉種，工作量大;

⑤雜菌的汙染機會較多。

該法較前一種方法保存菌種的時間更長，適用於黴菌、酵母菌
、fangxianjunjixuyangxijundengdebaocun。cifakefangzhiganzao，bingtongguoxianzhiyangdegonggeierdadaoxueruoweishengwudaixiezuoyongdemude。qijuyoufangfajianbiandeyoudian，tongshiyeshiyongyubuyilengdongganzaodeweishengwu(如產孢能力低的絲狀菌)的保存，而某些細菌如固氮菌、乳酸杆菌、明串珠菌、分枝杆菌、紅螺菌及沙門氏菌等和一些真菌如卷黴菌
、小克銀漢黴、毛黴、根黴等不宜采用此法進行保存。

即將微生物吸附在適當載體上進行幹燥保存的方法。常用的有方法包括以下幾種

，如：

①土壤保存法：主(zhu)要(yao)用(yong)於(yu)能(neng)形(xing)成(cheng)孢(bao)子(zi)或(huo)孢(bao)囊(nang)的(de)微(wei)生(sheng)物(wu)菌(jun)種(zhong)的(de)保(bao)藏(zang)。方(fang)法(fa)是(shi)在(zai)滅(mie)菌(jun)的(de)土(tu)壤(rang)中(zhong)加(jia)入(ru)菌(jun)液(ye)，立(li)即(ji)在(zai)室(shi)溫(wen)下(xia)進(jin)行(xing)幹(gan)燥(zao)或(huo)使(shi)菌(jun)體(ti)繁(fan)殖(zhi)後(hou)再(zai)幹(gan)燥(zao)，然(ran)後(hou)冷(leng)藏(zang)或(huo)在(zai)室(shi)溫(wen)下(xia)密(mi)封(feng)保(bao)存(cun)。保(bao)存(cun)用(yong)的(de)土(tu)壤(rang)原(yuan)則(ze)上(shang)以(yi)肥(fei)沃(wo)的(de)耕(geng)土(tu)為(wei)宜(yi)
，土(tu)壤(rang)需(xu)風(feng)幹(gan)、粉碎
、過篩和滅菌。使微生物在土壤中繁殖後進行幹燥保存的方法是：取適量土壤(5克)，置於塞有棉塞的試管中，加水或加入充分稀釋的液體培養基(以含水量為土壤最大持水量的60%為宜)，然(ran)後(hou)高(gao)壓(ya)滅(mie)菌(jun)。再(zai)將(jiang)需(xu)保(bao)存(cun)的(de)微(wei)生(sheng)物(wu)進(jin)行(xing)大(da)量(liang)接(jie)種(zhong)，培(pei)養(yang)至(zhi)菌(jun)絲(si)能(neng)用(yong)肉(rou)眼(yan)確(que)認(ren)的(de)程(cheng)度(du)為(wei)止(zhi)，移(yi)入(ru)幹(gan)燥(zao)器(qi)中(zhong)經(jing)短(duan)時(shi)間(jian)幹(gan)燥(zao)或(huo)風(feng)幹(gan)後(hou)密(mi)封(feng)，冷(leng)藏(zang)或(huo)室(shi)溫(wen)保(bao)存(cun)。

②砂土保存法：取清潔的砂，篩去掉大砂粒，並用磁鐵吸去砂中鐵屑
，再用NaOH溶液、10%HCl溶液和水交替清洗數次，幹燥後，置於試管或安瓶管中保持2～3cm深，再經幹熱滅菌後，加入1mL菌種培養液，經充分混勻後，放入真空幹燥器中
，完全幹燥後熔封保存。也可用二份洗淨的砂(經HCl預處理)和一份貧瘠、過篩的黃土攙和後滅菌，再進行菌種保藏。

③矽膠保存法：以6～16目的無色矽膠代替砂子
，幹熱滅菌後，加入菌液。加菌液時，由於矽膠的吸附熱常使溫度升高，因而需設法加以冷卻。

④磁珠保存法：將菌液浸入素燒磁珠(或多孔玻璃珠)後再進行幹燥保存的一種方法。在螺旋口試管中裝入1/2管高的矽膠(或無水CaSO4)
，上鋪玻璃棉
，再放上10～20粒磁珠
，經幹熱滅菌後
，接入菌懸液，最後冷藏
、室溫保藏或減壓幹燥後密封保藏。本法對酵母菌很有效，特別適用於根瘤菌
，可保存長達兩年半時間。

⑤麩皮保存法：在麩皮內加入60%的水

，經滅菌後接種培養，最後幹燥保藏。

⑥紙片(濾紙)保存法：將滅菌紙片浸入培養液或菌懸液中，常壓或減壓幹燥後，置於裝有幹燥劑的容器內進行保存。

即使微生物混懸於適當溶液中進行保存的方法。常用的方法有：

①蒸餾水保存法：適用於黴菌、酵母菌及絕大部分放線菌，將其菌體懸浮於蒸餾水中即可在室溫下保存數年。本法應注意避免水分的蒸發。

②糖液保存法：適用於酵母菌，如將其菌體懸浮於10%的蔗糖溶液中，然後於冷暗處保存，可長達10年。除此之外，也可使用緩衝液或食鹽水等進行保存。

即令微生物侵入其寄主後加以保存的方法。用於目前尚不能在人工培養基上生長的微生物，如病毒
、立克次氏體、螺旋體等
，它們必須在生活的動物
、昆蟲
、jipeineiganranbingchuandai，cifaxiangdangyuyibanweishengwudechuandaipeiyangbaozangfa。bingdudengweishengwuyikeyongqitafangfaruyedanbaozangfayulengdongganzaobaozangfajinxingbaozang。

適(shi)用(yong)於(yu)抗(kang)凍(dong)力(li)強(qiang)的(de)微(wei)生(sheng)物(wu)。這(zhe)些(xie)微(wei)生(sheng)物(wu)可(ke)在(zai)其(qi)菌(jun)體(ti)細(xi)胞(bao)外(wai)遭(zao)受(shou)凍(dong)結(jie)的(de)情(qing)況(kuang)下(xia)而(er)不(bu)受(shou)損(sun)傷(shang)，而(er)對(dui)其(qi)它(ta)大(da)多(duo)數(shu)微(wei)生(sheng)物(wu)而(er)言(yan)，無(wu)論(lun)在(zai)細(xi)胞(bao)外(wai)凍(dong)結(jie)還(hai)是(shi)在(zai)細(xi)胞(bao)內(nei)凍(dong)結(jie)，都(dou)會(hui)對(dui)菌(jun)體(ti)造(zao)成(cheng)損(sun)傷(shang)，當(dang)采(cai)用(yong)這(zhe)種(zhong)保(bao)藏(zang)方(fang)法(fa)時(shi)
，應(ying)注(zhu)意(yi)以(yi)下(xia)幾(ji)點(dian)：

①   要選擇適於冷凍幹燥的菌齡細胞。

②   要選擇適宜的培養基

，因為某些微生物對冷凍的抵抗力

，常隨培養基成分的變化而顯示出巨大差異。

③   要選擇合適的菌液濃度，通常菌液濃度越高，生存率越高，保存期也越長。

④   最好在菌液內不添加電解質(如食鹽等)。

⑤   可在菌液內添加甘油等保護劑
，以防止在冷凍過程中出現菌體大量死亡的現象。同樣，也可添加各種糖類、去纖維血液和脫脂牛乳等具有良好保護效果的溶劑，但對有些微生物而言

，不加保護劑時更有效。

⑥   原則上應盡快進行冷凍處理，但當加入保護劑時
，可靜置一段時間後再進行處理。

⑦   就動物細胞而言，應在-20℃範圍內以1℃/min左右的速度緩慢降溫
，此後必須盡快降到貯藏溫度；而對絕大多數微生物而言，則不必如此，如結構較為複雜的原蟲則可在-35℃範圍內進行緩慢降溫

，而噬菌體則必需采用上述的二階段法進行冷凍。

⑧   若進行長期保存，則貯藏溫度越低越好。

⑨取用冷凍保存的菌種時
，應采取速融措施
，即在35～40℃溫wen水shui中zhong輕qing輕qing振zhen蕩dang使shi之zhi迅xun速su融rong解jie。而er就jiu厭yan氧yang菌jun來lai說shuo，則ze應ying選xuan擇ze靜jing置zhi融rong化hua的de措cuo施shi。當dang冷leng凍dong菌jun融rong化hua後hou，應ying盡jin量liang避bi免mian再zai次ci冷leng凍dong，否fou則ze菌jun體ti的de存cun活huo率lv將jiang顯xian著zhu下xia降jiang。

常用的冷凍保存法包括：
①低溫冰箱保存法(-20℃、-50℃或-85℃)：

低di溫wen冷leng凍dong保bao存cun時shi使shi用yong螺luo旋xuan口kou試shi管guan較jiao為wei方fang便bian，也ye可ke在zai棉mian塞sai試shi管guan外wai包bao裹guo塑su料liao薄bo膜mo。保bao存cun時shi菌jun液ye加jia量liang不bu宜yi過guo多duo，有you些xie可ke添tian加jia保bao護hu劑ji。此ci外wai
，也ye可ke用yongφ5mm的玻璃珠來吸附菌液


，然後把玻璃珠置於塑料容器內，再放入低溫冰箱內進行保存的。

②幹冰保存法(-70℃左右)：

即將菌種管插入幹冰內
，再置於冰箱內進行冷凍保存

；

③液氮保存法(-196℃)：

是適用範圍最廣的微生物保存法。

其操作步驟如下：

a
、裝安瓶管：使用盡量濃厚的菌體懸浮於含有適當防凍劑(保存黴菌不用防凍劑)的滅菌溶液中
，將0.2～1mL的這種溶液分裝於安瓶中，或在裝有分散劑的安瓶中直接接種
，或將菌絲體瓊脂塊直接懸浮於分散劑中。

b

、熔封安瓶管：若直接貯存於氣相液氮中(-150℃～-170℃)時

，則不需熔封。

c
、檢查安瓶管是否熔封良好：即在4℃下，將熔封安瓶管在適當的色素溶液中浸泡2～30分鍾後，觀察有無色素進入安瓶。

d、緩慢冷卻：將熔封安瓶管置於小罐中
，然後用液氮氣以約1℃/min的速度冷卻至-25℃左右
，也可在-20℃～-25℃的冰箱內緩慢冷卻30～60min。

e、速冷：最後浸入液氮中快速冷卻至-196℃。

其qi原yuan理li是shi首shou先xian將jiang微wei生sheng物wu冷leng凍dong，然ran後hou在zai減jian壓ya下xia利li用yong升sheng華hua現xian象xiang除chu去qu水shui分fen。事shi實shi上shang
，從cong菌jun體ti中zhong除chu去qu大da部bu分fen水shui分fen後hou，細xi胞bao的de生sheng理li活huo動dong就jiu會hui停ting止zhi
，因yin此ci可ke以yi達da到dao長chang期qi維wei持chi生sheng命ming狀zhuang態tai的de目mu的de。該gai方fang法fa適shi用yong於yu絕jue大da多duo數shu微wei生sheng物wu菌jun種zhong(包括噬菌體和立克次氏體等)的保存。在進行冷凍幹燥時
，需注意以下幾個問題：　
a、冷凍幹燥前的培養條件：首先檢驗菌種純度。一般地說
，將待保存的微生物在營養豐富且容易增菌的培養基上進行培養為宜;菌齡以達到對數生長期為好;若為有芽孢或孢子的微生物，則以芽孢和孢子形成以後進行保存為好;菌液濃度以高為好，如細菌應達到109～1010/mL。

b、菌株號碼等的標記：可在安瓶外側標記或在安瓶內封入標簽。

c
、安瓶的準備：將安瓶在2%HCl中浸泡過夜
，自來水衝洗3次後，蒸餾水刷淨
，幹燥

，塞棉塞，貼標簽，幹熱滅菌或溫熱滅菌後，60℃恒溫幹燥。

d

、添加保護劑：常用的保護劑有脫脂乳、12%蔗糖
、加7.5%葡萄糖的普通肉湯以及加7.5%葡萄糖的血清等。甘油管保藏法：在5mL菌種保藏管中，將等體積的菌懸液和40%的甘油充分混勻後，於-20℃冰箱中保存。

在5ml菌種保藏管中
，將等體積的菌懸液和40%的甘油充分混勻後，於-20℃冰箱中保存。