革蘭染色法是1884年由丹麥醫師Gram創立，直到現今，革蘭氏染色法仍是細菌學中廣泛使用的一種鑒別染色法。

細菌(jun)先(xian)經(jing)堿(jian)性(xing)染(ran)料(liao)結(jie)晶(jing)紫(zi)染(ran)色(se)，而(er)後(hou)經(jing)碘(dian)液(ye)進(jin)行(xing)媒(mei)染(ran)，之(zhi)後(hou)用(yong)酒(jiu)精(jing)脫(tuo)色(se)，在(zai)一(yi)定(ding)條(tiao)件(jian)下(xia)有(you)的(de)細(xi)菌(jun)媒(mei)染(ran)後(hou)的(de)顏(yan)色(se)不(bu)被(bei)脫(tuo)去(qu)，有(you)的(de)可(ke)被(bei)脫(tuo)去(qu)，因(yin)此(ci)可(ke)把(ba)細(xi)菌(jun)分(fen)為(wei)兩(liang)大(da)類(lei)，前(qian)者(zhe)叫(jiao)做(zuo)革(ge)蘭(lan)氏(shi)陽(yang)性(xing)菌(jun)(G+),後者為革蘭氏陰性菌(G-)。為wei方fang便bian進jin一yi步bu觀guan察cha，脫tuo色se後hou可ke再zai用yong一yi種zhong紅hong色se染ran料liao如ru堿jian性xing番fan紅hong等deng進jin行xing複fu染ran。陽yang性xing菌jun仍reng帶dai紫zi色se，陰yin性xing菌jun則ze被bei重zhong新xin染ran上shang紅hong色se。有you芽ya孢bao的de杆gan菌jun和he絕jue大da多duo數shu的de球qiu菌jun，以yi及ji所suo有you的de放fang線xian菌jun和he真zhen菌jun都dou呈cheng革ge蘭lan氏shi正zheng反fan應ying；弧菌、螺旋體和大多數致病性的無芽孢杆菌都呈現負反應。

革ge蘭lan氏shi陽yang性xing菌jun和he革ge蘭lan氏shi陰yin性xing菌jun在zai化hua學xue組zu成cheng和he生sheng理li性xing質zhi上shang有you很hen多duo差cha別bie，染ran色se反fan應ying不bu一yi樣yang。現xian在zai一yi般ban認ren為wei革ge蘭lan氏shi陽yang性xing菌jun體ti內nei含han有you特te殊shu的de核he蛋dan白bai質zhi鎂mei鹽yan與yu多duo糖tang的de複fu合he物wu，它ta與yu碘dian和he結jie晶jing紫zi的de複fu合he物wu結jie合he很hen牢lao，不bu易yi脫tuo色se，陰yin性xing菌jun複fu合he物wu結jie合he程cheng度du底di
，吸xi附fu染ran料liao差cha，易yi脫tuo色se，這zhe是shi染ran色se反fan應ying的de主zhu要yao依yi據ju。

另外，陽性菌菌體等電點較陰性菌為低
，在相同pH條件下進行染色，陽性菌吸附堿性染料很多
，因此不易脫去
，陰性菌則相反。所以染色時的染色液pH和染色時間等條件要嚴格控製。例如，在強堿的條件下進行染色，兩類菌吸附堿性染料都多，都可呈正反應
； pH很低時

，則都可呈負反應。此外
，兩類菌的細胞壁等對結晶紫-碘複合物的通透性也不一致，陽性菌透性小，故不易被脫色，陰性菌透性大

，易脫色。所以脫色時間、脫色方法也應嚴格控製。

革蘭氏染色法一般包括初染、媒染
、脫色
、複染等四個步驟
，具體操作方法是： 

(一)塗片固定

在(zai)幹(gan)淨(jing)的(de)載(zai)玻(bo)片(pian)中(zhong)央(yang)滴(di)加(jia)一(yi)滴(di)蒸(zheng)餾(liu)水(shui)
，用(yong)接(jie)種(zhong)環(huan)進(jin)行(xing)無(wu)菌(jun)操(cao)作(zuo)
，挑(tiao)取(qu)培(pei)養(yang)物(wu)少(shao)許(xu)，置(zhi)載(zai)玻(bo)片(pian)的(de)水(shui)滴(di)中(zhong)，與(yu)水(shui)混(hun)合(he)做(zuo)成(cheng)菌(jun)懸(xuan)液(ye)並(bing)塗(tu)布(bu)成(cheng)直(zhi)徑(jing)約(yue)1cmdeboceng。weibimianyinjunshuguoduojujichengtuan，buliyuguanchaxijungetixingtai，kezaizaibopianyicejinxingshangshucaozuo
，erzailingyicezaijiayidishui，congyitubudejunyezhongzaiquyihuanyucishuidizhongjinxingxishi，tubuchengboceng。ruocailiaoweiyetipeiyangwuhuogutipeiyangwuzhongxixiazhibeidejunye，zezhijietubuyuzaibopianshangjike

，rujunyenongdujiaoda，yekeshiyongshuidizaijinxingyicixishi。

塗tu片pian最zui好hao在zai室shi溫wen條tiao件jian下xia使shi其qi自zi然ran幹gan燥zao，有you時shi為wei了le使shi之zhi幹gan得de更geng快kuai些xie，可ke將jiang標biao本ben麵mian向xiang上shang
，手shou持chi載zai玻bo片pian一yi端duan的de兩liang側ce，小xiao心xin地di在zai酒jiu精jing燈deng火huo焰yan上shang方fang較jiao高gao的de位wei置zhi微wei微wei加jia熱re，使shi水shui分fen蒸zheng發fa，但dan切qie勿wu緊jin靠kao火huo焰yan或huo加jia熱re時shi間jian過guo長chang，以yi防fang標biao本ben烤kao枯ku而er變bian形xing。

標本幹燥後即進行固定，固定的目的有三個：

(1)殺死微生物，固定細胞結構。

(2)保證菌體能更牢固的粘附在載玻片上，防止標本水洗時被水衝洗掉。

(3)改變染料對細胞的通透性，因為死的原生質比活的原生質易於染色。

固定常常利用高溫，手執載玻片的一端(塗有標本的遠端),標本向上，在酒精燈火焰外層盡快的來回通過3-4次，共約2s-3s,並不時以載玻片背麵加熱
，載玻片背麵觸皮膚，以不覺過燙為宜(不超過60℃),待放置冷後，再進行染色。

（二)染色

在固定過的塗片菌膜上滴加草酸銨結晶紫染液，染色液應完全覆蓋整個菌膜，染色1min。

(三)水洗

染色到一定的時間，拿住玻片使之成450角，用細小的水流把多餘的染料衝洗掉，被菌體吸附的染料則保留。

(四)媒染

加碘液覆蓋塗麵染1 min。在媒染處理時


，媒染劑與染料形成不溶性的化合物，可增加染料和細菌的親和力。

(五)水洗
，用吸水紙吸去水分

用細小的水流緩慢衝洗塗片上的染色液，用吸水紙吸幹。

(六)脫色

加95%酒精數滴
，並輕輕搖動進行脫色， 20 s~30 s後再進行水洗
，吸去水分。

(七)複染

蕃紅染色液染色10 s後， 自來水衝洗。

(八)幹燥，鏡檢

染色的結果
，革蘭氏正反應菌體都呈紫色，負反應菌體都呈紅色。

(1)水shui流liu衝chong洗xi時shi
，將jiang載zai玻bo片pian微wei微wei傾qing斜xie
，讓rang水shui流liu從cong塗tu菌jun處chu的de上shang方fang而er不bu要yao直zhi接jie在zai塗tu菌jun處chu衝chong洗xi，同tong時shi應ying調tiao小xiao水shui流liu避bi免mian染ran色se液ye飛fei濺jian。染ran色se液ye如ru果guo滴di在zai水shui池chi或huo桌zhuo麵mian上shang，可ke以yi用yong84消毒液擦拭去掉顏色，但要注意84消毒液不可直接用於皮膚和衣物等。

(2)在實驗中經常會出現假陽性和假陰性的結果，假陽性主要是由於脫色不完全



，可(ke)能(neng)是(shi)由(you)於(yu)塗(tu)片(pian)過(guo)厚(hou)或(huo)者(zhe)是(shi)結(jie)晶(jing)紫(zi)染(ran)色(se)過(guo)度(du)等(deng)，導(dao)致(zhi)脫(tuo)色(se)不(bu)完(wan)全(quan)。假(jia)陰(yin)性(xing)可(ke)能(neng)是(shi)因(yin)為(wei)細(xi)胞(bao)固(gu)定(ding)過(guo)度(du)，造(zao)成(cheng)細(xi)胞(bao)壁(bi)通(tong)透(tou)性(xing)的(de)改(gai)變(bian)
，而(er)出(chu)現(xian)假(jia)陰(yin)性(xing)結(jie)果(guo)
；另ling外wai，細xi胞bao培pei養yang時shi間jian過guo長chang，可ke能neng已yi經jing有you部bu分fen細xi胞bao發fa生sheng死si亡wang或huo自zi溶rong，也ye導dao致zhi細xi胞bao壁bi通tong透tou性xing的de改gai變bian而er出chu現xian假jia陰yin性xing的de結jie果guo。避bi免mian假jia陽yang性xing或huo假jia陰yin性xing的de辦ban法fa是shi在zai同tong一yi張zhang載zai玻bo片pian上shang設she置zhi革ge蘭lan氏shi陽yang性xing菌jun(如金黃色葡萄球菌) 和革蘭氏陰性菌(如大腸杆菌)的對照與待染色的菌一起進行染色， 當對照菌呈現預期的染色結果時表明染色過程正常。

(3)所觀察的細胞一般應用18 h~24 h的活力培養物。因為一此菌株隨菌齡的變化在革氏染色反應和形態學上也會發生變化。