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磷酸鹽緩衝稀釋液
貯存液：
磷酸二氫鉀(KH2PO4) 34.0g
蒸餾水 500mL
用大約175 mL的1mol/L氫氧化鈉溶液調節pH至7.2（圖1-1、1-2），用蒸餾水稀釋至1000 mL後貯存於冰箱。
稀釋液：用蒸餾水稀釋1.25mL貯存液至1000mL,分裝於合適容器,121℃高壓滅菌15min。
2. 培養基製作
① 計算出所需數量，用電子稱、稱量紙、藥勺來稱取。
② 放入比所用蒸餾水大的燒瓶中，使之充分混勻於蒸餾水後加熱溶解並煮沸。
※ 備注：即使是同一培養基，各個廠家的配製方法多少有些不同，所以一定要充分參照培養基上的說明。
2.1 傾注培養培養基：
● 平板計數瓊脂等：高壓滅菌後保存，使用時加溫溶解。
● 去氧膽酸鹽瓊脂培養基：使用時將培養基粉末加溫溶解。
※ 備注：傾注培養時，向培養基分注的步驟參照下述的注意事項
①樣液稀釋以及從接種到培養基混合完畢，最好在15分鍾以內完成。
②每個平皿的分注量約15-20ml。分注後將平皿傾斜和旋轉使之充分混合，但要注意不要讓培養基從平皿內溢出，且不要粘附在平皿壁和蓋上。
③分注時三角燒瓶掛有培養基滴時，下一次分注的培養基可能被燒瓶外壁的細菌汙染，所以要用酒精棉擦拭，再將瓶口用火焰滅菌。
2.2 平板培養基：
平板培養基是將溶解後的培養基分注15-20ml到無菌平皿裏，使之凝固。
●TCBS瓊脂培養基、DHL瓊脂培養基：加溫溶解後，分注、凝固、幹燥表麵。為了防止沉澱的發生，加溫溶解後要充分混勻（注意不要起泡）。
●EMB瓊脂培養基：高壓滅菌後，分注、凝固、幹燥表麵。
●卵黃甘露醇高鹽瓊脂培養基：將雞蛋放在95%酒精中浸泡1小時左右，用酒精棉（紗布）擦拭蛋殼表麵，打開雞蛋取出卵黃。加入經高壓滅菌後冷卻到55-60℃培養基裏（6%卵黃）攪拌搖勻凝固後幹燥表麵（攪拌時不要起泡）。若培養基溫度過高，卵黃凝固，過低則培養基分注時開始結塊，所以操作要迅速。
※ 備注：分注後將平皿蓋打開置於無菌工作台/恒溫培養箱內使培養基表麵幹燥。
幹燥時間基準如下：
無菌超淨台：15分鍾
37℃恒溫箱內倒置：20-30分鍾
2.3 斜麵/高層斜麵培養基：
加溫溶解後的培養基分注到小試管3-4ml，中試管8-10ml。高壓滅菌後將試管冷卻至50℃左右（以防斜麵上冷凝水太多），將試管口端擱在合適高度的器具上，擱置斜麵長度以不超過試管總長一半為宜。高層斜麵培養基製成斜麵高1/3，高層為2/3。
●營養瓊脂培養基：加溫溶解後分注到中試管，高壓滅菌後製成斜麵。
●TSI瓊脂培養基：加溫溶解後分注到小試管，高壓滅菌後製成高層斜麵。
2.4 液體培養基
加溫溶解後的培養基和高層/斜麵培養基一樣，分注。一般液體培養基因過度加熱易引起培養基變質,所以加熱（加溫溶解、高壓滅菌）後用流動水等急速冷卻。
●EC、BGLB培養基：加溫溶解後分注到放有倒立的發酵管的試管後高壓滅菌，滅菌後用流動水急速冷卻。
●EEM培養基：加溫溶解後於三角瓶在100℃滅菌30分鍾。
※ 備注：每批培養基製備後，應仔細檢查一遍，如發現破裂、水分浸入、色澤異常、瓶塞被培養基汙染等，均應挑出棄去。培養基應存放於冷暗處，最好放於冰箱內。放置時間不宜超過一周，傾注的平皿培養基不宜超過3天。每批培養基均必須附有明顯的標識。
3. 基本操作：
3.1 滅菌方法：
①酒精殺菌：用75%的酒精及酒精棉，用於手指、實驗台、工器具、樣品外包裝等的殺菌。
②火焰滅菌：檢查中常用酒精燈/煤氣燈，將燒瓶、試管、吸管、剪刀、鑷子瓶口部或前端，還有接種針、接種環接種前後通過火焰。
③ 高壓滅菌：主要是吸管、培養基、稀釋水以及檢查完畢後的培養基等無菌。
④煮沸滅菌：在沸水中加熱15-30min的方法。用於鑷子、剪刀、吸球等的工具滅菌。
3.2.1 平皿劃線：
3.2.1.1分段劃線：用於含菌量較多的樣品。
右手持接種環柄，將接種環垂直放在火焰上灼燒。鎳鉻絲部分（環和絲）必bi須xu燒shao紅hong，以yi達da到dao滅mie菌jun目mu的de，然ran後hou將jiang除chu手shou柄bing部bu分fen的de金jin屬shu杆gan全quan用yong火huo焰yan灼zhuo燒shao一yi遍bian，尤you其qi是shi接jie鎳nie鉻ge絲si的de螺luo口kou部bu分fen，要yao徹che底di灼zhuo燒shao以yi免mian滅mie菌jun不bu徹che底di。（圖3-1、3-2）
用左手拇指和食指或中指使平皿開啟成一縫，將滅過菌並冷卻的接種環挑取菌（可在瓊脂表麵邊緣空白處試溫度，若發出濺潑聲，表示太燙）先在平板培養基的一邊輕輕研磨作第一次平行劃線，再轉動平皿約70度du角jiao，並bing將jiang接jie種zhong環huan上shang剩sheng餘yu物wu燒shao掉diao，待dai冷leng卻que後hou通tong過guo第di一yi次ci劃hua線xian部bu分fen作zuo第di二er次ci平ping行xing劃hua線xian，再zai用yong同tong樣yang的de方fang法fa通tong過guo第di二er次ci劃hua線xian部bu分fen作zuo第di三san次ci劃hua線xian或huo通tong過guo第di三san次ci平ping行xing劃hua線xian部bu分fen作zuo第di四si次ci平ping行xing劃hua線xian。（圖3-3、3-4）
3.2.1.2連續劃線：含菌量不多的樣品。
先將接種環用火焰滅菌，待冷卻後挑取菌，塗於平板的上端，隨即向下連續平行劃線。（圖3-5）
※備注：
（1）劃線時接種環與平板表麵所成的角度為45度角，以免劃破瓊脂。劃線要盡量直、密、勻而不重複。（圖3-7）
（2）將(jiang)沾(zhan)有(you)菌(jun)苔(tai)的(de)接(jie)種(zhong)環(huan)在(zai)火(huo)焰(yan)上(shang)燒(shao)紅(hong)滅(mie)菌(jun)。先(xian)在(zai)火(huo)焰(yan)內(nei)焰(yan)中(zhong)燒(shao)灼(zhuo)，使(shi)其(qi)幹(gan)燥(zao)後(hou)，再(zai)在(zai)外(wai)焰(yan)中(zhong)燒(shao)紅(hong)，以(yi)免(mian)菌(jun)苔(tai)驟(zhou)熱(re)，使(shi)菌(jun)體(ti)爆(bao)濺(jian)，造(zao)成(cheng)汙(wu)染(ran)。（圖3-6）
3.2.2 塗布方法：
將菌懸液小心滴在平板培養基表麵中央位置（圖3-8），youshounawujuntububangpingfangzaipingbanpeiyangjibiaomian，jiangjunxuanyexianyanyitiaozhixianqingqinglaihuituidong，shizhifenbujunyun，ranhougaibianfangxiangyanlingyitiaochuizhixianlaihuituidong，pingbanneibianyuanchukegaibianfangxiangyongtububangzaitubujici，shijunyejunyunxishou （圖3-9、3-11）。（或將無菌塗布棒平放在平板培養基表麵，將菌懸液沿同心圓方向輕輕地向外擴展）使之分布均勻（圖3-10）。室溫下靜置5～l0min，使菌液滲透於培養基。
3.2.3 液體接種法
3.2.3.1 由斜麵培養物接種至液體培養基：用(yong)接(jie)種(zhong)環(huan)從(cong)斜(xie)麵(mian)上(shang)沾(zhan)取(qu)少(shao)許(xu)菌(jun)苔(tai)，接(jie)至(zhi)液(ye)體(ti)培(pei)養(yang)基(ji)時(shi)應(ying)在(zai)管(guan)內(nei)靠(kao)近(jin)液(ye)麵(mian)試(shi)管(guan)壁(bi)上(shang)將(jiang)菌(jun)苔(tai)輕(qing)輕(qing)研(yan)磨(mo)並(bing)輕(qing)輕(qing)振(zhen)蕩(dang)，或(huo)將(jiang)接(jie)種(zhong)環(huan)在(zai)液(ye)體(ti)內(nei)振(zhen)搖(yao)幾(ji)次(ci)即(ji)可(ke)。
3.2.3.2由液體培養物接種液體培養基時：可用接種環或接種針沾取少許液體移至新液體培養基即可。也可根據需要用吸管、滴管或注射器吸取培養液移至新液體培養基即可。 （圖3-12、3-13）
※ 備注：
3.2.4 斜麵接種法
將菌種斜麵培養基(簡稱菌種管)與待接種的新鮮斜麵培養基(簡稱接種管)持在左手拇指、食指、中指及無名指之間，菌種管在前，接種管在後，斜麵向上管口對齊，應斜持試管呈45～50dujiao，bingnengqingchudikandaolianggeshiguandexiemian，yongyoushoudexiaozhiheshouzhangzhijianjiwumingzhihexiaozhizhijianbochushiguansai，jiangshiguankouzaihuoyanshangtongguo，yishamiekenengzhanwudeweishengwu。shiguansaiyingshizhongjiazaishouzhongrudiaoluoyinggenghuanwujunshiguan。
將(jiang)灼(zhuo)燒(shao)滅(mie)菌(jun)的(de)接(jie)種(zhong)環(huan)插(cha)入(ru)菌(jun)種(zhong)管(guan)內(nei)，先(xian)接(jie)觸(chu)無(wu)菌(jun)苔(tai)生(sheng)長(chang)的(de)培(pei)養(yang)基(ji)上(shang)，待(dai)冷(leng)卻(que)後(hou)再(zai)從(cong)斜(xie)麵(mian)上(shang)刮(gua)取(qu)少(shao)許(xu)菌(jun)苔(tai)取(qu)出(chu)，接(jie)種(zhong)環(huan)不(bu)能(neng)通(tong)過(guo)火(huo)焰(yan)，應(ying)在(zai)火(huo)焰(yan)旁(pang)迅(xun)速(su)插(cha)入(ru)接(jie)種(zhong)管(guan)。在(zai)試(shi)管(guan)中(zhong)由(you)下(xia)往(wang)上(shang)劃(hua)線(xian)。接(jie)種(zhong)完(wan)畢(bi)，接(jie)種(zhong)環(huan)應(ying)通(tong)過(guo)火(huo)焰(yan)抽(chou)出(chu)管(guan)口(kou)，並(bing)迅(xun)速(su)塞(sai)上(shang)試(shi)管(guan)塞(sai)。再(zai)重(zhong)新(xin)仔(zai)細(xi)灼(zhuo)燒(shao)接(jie)種(zhong)環(huan)後(hou)，放(fang)回(hui)原(yuan)處(chu)，並(bing)塞(sai)緊(jin)試(shi)管(guan)塞(sai)。將(jiang)接(jie)種(zhong)管(guan)做(zuo)好(hao)標(biao)記(ji)後(hou)再(zai)放(fang)入(ru)試(shi)管(guan)架(jia)，即(ji)可(ke)進(jin)行(xing)培(pei)養(yang)。
3.2.5 穿刺接種法
接種高層或半高層斜麵培養管時，用接種針挑取菌落，向培養基中心穿刺，一直插到接近管底0.4cm處，再沿原路抽出接種針。注意勿使接種針在培養基內左右移動，以使穿刺線整齊，便於觀察生長結果。（圖3-15、3-16）
