熒光顯微鏡原理熒光顯微鏡是免疫熒光細胞化學的基本工具。它是由光源、濾板係統和光學係統等主要部件組成。是利用一定波長的光激發標本發射熒光
，通過物鏡和目鏡係統放大以觀察標本的熒光圖像

(一)光源

現在多采用200W的de超chao高gao壓ya汞gong燈deng作zuo光guang源yuan
，它ta是shi用yong石shi英ying玻bo璃li製zhi作zuo，中zhong間jian呈cheng球qiu形xing，內nei充chong一yi定ding數shu量liang的de汞gong
，工gong作zuo時shi由you兩liang個ge電dian極ji間jian放fang電dian，引yin起qi水shui銀yin蒸zheng發fa，球qiu內nei氣qi壓ya迅xun速su升sheng高gao，當dang水shui銀yin完wan全quan蒸zheng發fa時shi，可ke達da50～70個標準大氣壓力，這一過程一般約需5～15min。超(chao)高(gao)壓(ya)汞(gong)燈(deng)的(de)發(fa)光(guang)是(shi)電(dian)極(ji)間(jian)放(fang)電(dian)使(shi)水(shui)銀(yin)分(fen)子(zi)不(bu)斷(duan)解(jie)離(li)和(he)還(hai)原(yuan)過(guo)程(cheng)中(zhong)發(fa)射(she)光(guang)量(liang)子(zi)的(de)結(jie)果(guo)。它(ta)發(fa)射(she)很(hen)強(qiang)的(de)紫(zi)外(wai)和(he)藍(lan)紫(zi)光(guang)，足(zu)以(yi)激(ji)發(fa)各(ge)類(lei)熒(ying)光(guang)物(wu)質(zhi)，因(yin)此(ci)，為(wei)熒(ying)光(guang)顯(xian)微(wei)鏡(jing)普(pu)遍(bian)采(cai)用(yong)。

超高壓汞燈也散發大量熱能。因此，燈室必須有良好的散熱條件，工作環境溫度不宜太高。

新型超高壓汞燈在使用初期不需高電壓即可引燃，使用一些時間後，則需要高壓啟動(約為15000V)，啟動後

，維持工作電壓一般為50～60V，工作電流約4A左右。200W超高壓汞燈的平均壽命

，在每次使用2h的情況下約為200h，開動一次工作時間愈短，則壽命愈短，如開一次隻工作20min，則壽命降低50%。因yin此ci，使shi用yong時shi盡jin量liang減jian少shao啟qi動dong次ci數shu。燈deng泡pao在zai使shi用yong過guo程cheng中zhong
，其qi光guang效xiao是shi逐zhu漸jian降jiang低di的de。燈deng熄xi滅mie後hou要yao等deng待dai冷leng卻que才cai能neng重zhong新xin啟qi動dong。點dian燃ran燈deng泡pao後hou不bu可ke立li即ji關guan閉bi
，以yi免mian水shui銀yin蒸zheng發fa不bu完wan全quan而er損sun壞huai電dian極ji，一yi般ban需xu要yao等deng15min。由於超高壓汞燈壓力很高，紫外線強烈，因此燈泡必須置燈室中方可點燃
，以免傷害眼睛和發生爆炸時造成操作。

超高壓汞燈(100W或200W)光源的電路和包括變壓、鎮流、啟動幾個部分。在燈室上有調節燈泡發光中心的係統
，燈泡球部後麵安裝有鍍鋁的凹麵反射鏡，前麵安裝有集光透鏡。

國產超高壓汞燈GCQ-200型性能良好，可以代替HBO-200等型的進口燈泡，平均壽命在200h以上，價格也比較低。

我國研製的一種簡易輕便型高色溫溴鎢熒光光源裝置
，體積小，重量輕，功率小
，交、直流兩用(自帶直流電源)
，易於攜帶
，使用方便，已推廣應用。

(二)濾色係統

濾(lv)色(se)係(xi)統(tong)是(shi)熒(ying)光(guang)顯(xian)微(wei)鏡(jing)的(de)重(zhong)要(yao)部(bu)位(wei)
，由(you)激(ji)發(fa)濾(lv)板(ban)和(he)壓(ya)製(zhi)濾(lv)板(ban)組(zu)成(cheng)。濾(lv)板(ban)型(xing)號(hao)，各(ge)廠(chang)家(jia)名(ming)稱(cheng)常(chang)不(bu)統(tong)一(yi)。濾(lv)板(ban)一(yi)般(ban)都(dou)以(yi)基(ji)本(ben)色(se)調(tiao)命(ming)名(ming)
，前(qian)麵(mian)字(zi)母(mu)代(dai)表(biao)色(se)調(tiao)，後(hou)麵(mian)字(zi)母(mu)代(dai)表(biao)玻(bo)璃(li)，數(shu)字(zi)代(dai)表(biao)型(xing)號(hao)特(te)點(dian)。如(ru)德(de)國(guo)產(chan)品(pin)(Schott)BG12，就是種藍色玻璃
，B是藍色的第一個字母，G是玻璃的第一個字母；我國產品的名稱已統一用拚音字母表示
，如相當於BG12的藍色濾板名為QB24

，Q是青色(藍色)拚音的第一個字母
，B是玻璃拚音的第一個字母。不過有的濾板也可以透光分界濾長命名，如K530，就是表示壓製濾長530nm以下的光而透過530nm以上的光。還有的廠家的濾板完全以數字命名，如美國Corning廠的NO：5-58，即相當於BG12。

1．激發濾板根據光源和熒光色素的特點，可選用以下三類激發濾板
，提供一定波長範圍的激發光。

紫外光激發濾板：此濾板可使400nm以下的紫外光透過，阻擋400nm以上的可見光通過。常用型號為UG-1或UG-5
，外加一塊BG-38，以除去紅色尾波。

紫外藍光激發濾板：此濾板可使300～450nm範圍內的光通過。常用型號為ZB-2或ZB-3，外加BG-38。

紫藍光激發濾板：它可使350～490nm的光通過。常用型號為QB24(BG12)。

最大吸收峰在500nm以上者的熒光素(如羅達明色素)可用藍綠濾板(如B-7)激發。

近年開始采用金屬膜幹涉濾板
，由於針對性強，波長適當
，因而激發效果比較玻璃濾更好。如西德Leitz廠的FITC專用KP490濾板和羅達明的S546綠色濾板，均遠比玻璃濾板效果好。

激發濾板分薄厚兩種，一般暗視野選用薄濾板，亮視野熒光顯微鏡可選用厚一些。基本要求是以獲得最明亮的熒光和最好的背景為準。

2．壓製濾板壓製濾板的作用是完全阻擋激發光通過，提供相應濾長範圍的熒光。與激發濾板相對應，常用以下3種壓製濾板：

紫外光壓製濾板：可通過可見光、阻擋紫外光通過。能與UG-1或UG-5組合。常用GG-3K430或GG-6K460。

紫藍光壓製濾板：能通過510nm以上濾長的熒光(綠到紅)，能與BG-12組合。通常用OG-4K510或OG-1K530。

紫外紫光壓製濾板：能通過460nm以上波長的熒光(藍到紅)


，可與BG-3組合，常用OG-11K470AK490，K510。

(三)反光鏡

反光鏡的反光層一般是鍍鋁的，因為鋁對紫外光和可見光的藍紫區吸收少，反射達90%以上，而銀的反射隻有70%；一般使用平麵反光鏡。

(四)聚光鏡

專(zhuan)為(wei)熒(ying)光(guang)顯(xian)微(wei)鏡(jing)設(she)計(ji)製(zhi)作(zuo)的(de)聚(ju)光(guang)器(qi)是(shi)用(yong)石(shi)英(ying)玻(bo)璃(li)或(huo)其(qi)他(ta)透(tou)紫(zi)外(wai)光(guang)的(de)玻(bo)璃(li)製(zhi)成(cheng)。分(fen)明(ming)視(shi)野(ye)聚(ju)光(guang)器(qi)的(de)暗(an)視(shi)野(ye)聚(ju)光(guang)器(qi)兩(liang)種(zhong)。還(hai)有(you)相(xiang)差(cha)熒(ying)光(guang)聚(ju)光(guang)器(qi)。

1．明視野聚光器在一般熒光顯微鏡上多用明視野聚光器，它具有聚光力強，使用方便，特別適於低
、中倍放大的標本觀察。

2．暗an視shi野ye聚ju光guang器qi暗an視shi野ye聚ju光guang器qi在zai熒ying光guang顯xian微wei鏡jing中zhong的de應ying用yong日ri益yi廣guang泛fan。因yin為wei激ji發fa光guang不bu直zhi接jie進jin入ru物wu鏡jing，因yin而er除chu散san射she光guang外wai，激ji發fa光guang也ye不bu進jin入ru目mu鏡jing
，可ke以yi使shi用yong薄bo的de激ji發fa濾lv板ban，增zeng強qiang激ji發fa光guang的de強qiang度du

，壓ya製zhi濾lv板ban也ye可ke以yi很hen薄bo
，因yin紫zi外wai光guang激ji發fa時shi，可ke用yong無wu色se濾lv板ban(不透過紫外)而er仍reng然ran產chan生sheng黑hei暗an的de背bei景jing。從cong而er增zeng強qiang了le熒ying光guang圖tu像xiang的de亮liang度du和he反fan襯chen度du
，提ti高gao了le圖tu像xiang的de質zhi量liang，觀guan察cha舒shu適shi，可ke能neng發fa現xian亮liang視shi野ye難nan以yi分fen辨bian的de細xi微wei熒ying光guang顆ke粒li。

3．相xiang差cha熒ying光guang聚ju光guang器qi相xiang差cha聚ju光guang器qi與yu相xiang差cha物wu鏡jing配pei合he使shi用yong，可ke同tong時shi進jin行xing相xiang差cha和he熒ying光guang聯lian合he觀guan察cha，既ji能neng看kan到dao熒ying光guang圖tu像xiang
，又you能neng看kan到dao相xiang差cha圖tu像xiang，有you助zhu於yu熒ying光guang的de定ding位wei準zhun確que。一yi般ban熒ying光guang觀guan察cha很hen少shao需xu要yao這zhe種zhong聚ju光guang器qi。

(五)物鏡

各種物鏡均可應用，但最好用消色差的物鏡
，因其自體熒光極微且透光性能(波長範圍)shiheyuyingguang。youyutuxiangzaixianweijingshiyezhongdeyingguangliangduyuwujingjingkoulvdepingfangchengzhengbi
，eryuqifangdabeishuchengfanbi，suoyiweiletigaoyingguangtuxiangdeliangdu
，yingshiyongjingkoulvdadewujing。youqizaigaobeifangdashiqiyingxiangfeichangmingxian。yinciduiyingguangbugouqiangdebiaoben
，yingshiyongjingkoulvdadewujing，peiheyijinkenengdidemujing(4×,5×，6.3×等)。

(六)目鏡

在熒光顯微鏡中多用低倍目鏡
，如5×和6.3×。過去多用單筒目鏡
，因為其亮度比雙筒目鏡高一倍以上，但目前研究型熒光顯微鏡多用雙筒目鏡，觀察很方便。

(七)落射光裝置

新型的落射光裝置是從光源來的光射到幹涉分光濾鏡後，波長短的部分(紫外和紫藍)由於濾鏡上鍍膜的性質而反射，當濾鏡對向光源呈45。傾斜時，則垂直射向物鏡，經物鏡射向標本，使標本受到激發，這時物鏡直接起聚光器的作用。同時，濾長長的部分(綠、黃、紅等)，對dui濾lv鏡jing是shi可ke透tou的de，因yin此ci

，不bu向xiang物wu鏡jing方fang向xiang反fan射she，濾lv鏡jing起qi了le激ji發fa濾lv板ban作zuo用yong

，由you於yu標biao本ben的de熒ying光guang處chu在zai可ke見jian光guang長chang波bo區qu
，可ke透tou過guo濾lv鏡jing而er到dao達da目mu鏡jing觀guan察cha，熒ying光guang圖tu像xiang的de亮liang度du隨sui著zhe放fang大da倍bei數shu增zeng大da而er提ti高gao，在zai高gao放fang大da時shi比bi透tou射she光guang源yuan強qiang。它ta除chu具ju有you透tou射she式shi光guang源yuan的de功gong能neng外wai，更geng適shi用yong於yu不bu透tou明ming及ji半ban透tou明ming標biao本ben，如ru厚hou片pian、濾膜、菌落
、組織培養標本等的直接觀察。近年研製的新型熒光顯微鏡多采用落射光裝置
，稱之為落射熒光顯微鏡。
 

(一)載玻片

載玻片厚度應在0.8～1.2mm之zhi間jian，太tai厚hou的de坡po片pian，一yi方fang麵mian光guang吸xi收shou多duo，另ling一yi方fang麵mian不bu能neng使shi激ji發fa光guang在zai標biao本ben上shang聚ju集ji。載zai玻bo片pian必bi須xu光guang潔jie，厚hou度du均jun勻yun，無wu明ming顯xian自zi發fa熒ying光guang。有you時shi需xu用yong石shi英ying玻bo璃li載zai玻bo片pian。

(二)蓋玻片

蓋玻片厚度在0.17mm左右，光潔。為了加強激發光，也可用幹涉蓋玻片
，這是一種特製的表麵鍍有若幹層對不同波長的光起不同幹涉作用的物質(如氟化鎂)的蓋玻片

，它可以使熒光順利通過
，而反射激發光
，這種反射的激發光女可激發標本。

(三)標本

組(zu)織(zhi)切(qie)片(pian)或(huo)其(qi)他(ta)標(biao)本(ben)不(bu)能(neng)太(tai)厚(hou)，如(ru)太(tai)厚(hou)激(ji)發(fa)光(guang)大(da)部(bu)分(fen)消(xiao)耗(hao)在(zai)標(biao)本(ben)下(xia)部(bu)
，而(er)物(wu)鏡(jing)直(zhi)接(jie)觀(guan)察(cha)到(dao)的(de)上(shang)部(bu)不(bu)充(chong)分(fen)激(ji)發(fa)。另(ling)外(wai)，細(xi)胞(bao)重(zhong)迭(die)或(huo)雜(za)質(zhi)掩(yan)蓋(gai)，影(ying)響(xiang)判(pan)斷(duan)。

(四)封裱劑

封裱劑常用甘油
，必須無自發熒光，無色透明，熒光的亮度在pH8.5～9.5時較亮
，不易很快褪去。所以，常用甘油和0.5mol/lpH9.0～9.5的碳酸鹽緩衝液的等量混合液作封裱劑。

(五)鏡油

一yi般ban暗an視shi野ye熒ying光guang顯xian微wei鏡jing和he用yong油you鏡jing觀guan察cha標biao本ben時shi，必bi須xu使shi用yong鏡jing油you
，最zui好hao使shi用yong特te製zhi的de無wu熒ying光guang鏡jing油you，也ye可ke用yong上shang述shu甘gan油you代dai替ti，液ye體ti石shi蠟la也ye可ke用yong
，隻zhi是shi折zhe光guang率lv較jiao低di
，對dui圖tu像xiang質zhi量liang略lve有you影ying響xiang。

三、使用熒光顯微鏡的注意事項

(1)嚴格按照熒光顯微鏡出廠說明書要求進行操作，不要隨意改變程序。

(2)應在暗室中進行檢查。進入暗室後，接上電源，點燃超高壓汞燈5～15min，待光源發出強光穩定後
，眼睛完全適應暗室
，再開始觀察標本。

(3)防止紫外線對眼睛的損害，在調整光源時應戴上防護眼鏡。

(4)檢查時間每次以1～2h為宜
，超過90min，超高壓汞燈發光強度逐漸下降
，熒光減弱
；標本受紫外線照射3～5min後，熒光也明顯減弱；所以，最多不得超過2～3h。

(5)熒ying光guang顯xian微wei鏡jing光guang源yuan壽shou命ming有you限xian，標biao本ben應ying集ji中zhong檢jian查zha，以yi節jie省sheng時shi間jian，保bao護hu光guang源yuan。天tian熱re時shi，應ying加jia電dian扇shan散san熱re降jiang溫wen，新xin換huan燈deng泡pao應ying從cong開kai始shi就jiu記ji錄lu使shi用yong時shi間jian。燈deng熄xi滅mie後hou欲yu再zai用yong時shi，須xu待dai燈deng泡pao充chong分fen冷leng卻que後hou才cai能neng點dian燃ran。一yi天tian中zhong應ying避bi免mian數shu次ci點dian燃ran光guang源yuan。

(6)標本染色後立即觀察，因時間久了熒光會逐漸減弱。若將標本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延緩熒光減弱時間，防止封裱劑蒸發。

(7)熒光亮度的判斷標準：一般分為四級
，即“一”—無或可見微弱熒光。“ ”—僅能見明確可見的熒光。“ ”—可見有明亮的熒光。“ ”—可見耀眼的熒光。

四
、熒光圖像的記錄方法

yingguangxianweijingsuokandaodeyingguangtuxiang，yishijuyouxingtaixuetezheng，ershijuyouyingguangdeyanseheliangdu，zaipanduanjieguoshi，bixujiangerzhejieheqilaizonghepanduan。jieguojilugenjuzhuguanzhibiao
，jipinggongzuozhemuliguancha。zuoweiyibandingxingguancha
，jibenshangkekaode。suizhejishukexuedefazhan

，zaibutongchengdushangcaiyongkeguanzhibiaojilupanduanjieguo，ruyongxibaofenguangguangduji，tuxiangfenxiyidengyiqi。danzhexieyiqijiludejieguo，yebixujiehezhuguandepanduan。

熒ying光guang顯xian微wei鏡jing攝she影ying技ji術shu對dui於yu記ji錄lu熒ying光guang圖tu像xiang十shi分fen必bi要yao，由you於yu熒ying光guang很hen易yi褪tui色se減jian弱ruo
，要yao即ji時shi攝she影ying記ji錄lu結jie果guo。方fang法fa與yu普pu通tong顯xian微wei攝she影ying技ji術shu基ji本ben相xiang同tong。隻zhi是shi需xu要yao采cai用yong高gao速su感gan光guang膠jiao片pian如ruASA200以上或24。以上。因紫外光對熒光猝滅作用大，如FITC的標記物，在紫外光下照射30s，熒光亮度降低50%。所suo以yi，曝pu光guang速su度du太tai慢man，就jiu不bu能neng將jiang熒ying光guang圖tu像xiang拍pai攝she下xia來lai。一yi般ban研yan究jiu型xing熒ying光guang顯xian微wei鏡jing都dou有you半ban自zi動dong或huo全quan自zi動dong顯xian微wei攝she影ying係xi統tong裝zhuang置zhi。標biao本ben的de製zhi作zuo方fang法fa樣yang品pin須xu經jing過guo石shi蠟la包bao埋mai切qie片pian，然ran後hou用yong鐵tie礬fan蘇su木mu精jing染ran色se，普pu通tong光guang鏡jing觀guan察cha效xiao果guo還hai可ke以yi．
作熒光觀察需用熒光染料DAPI染色，

石蠟切片的過程：

1.取材:刀片要求鋒利而薄,組織厚度約2—3mm,大小1.5×1.5×0.2～0.3cm為宜.取材時間越快越好.

2.固定:組織取下後應立即放入10%福爾馬林(相當於4%甲醛)固定.

注意:(1).固定液量應為組織塊體積的40倍.

(2)固定時間固定時間與使用的固定液種類和組織塊大小,溫度等有關.一般為3—24h.

(3)固定溫度大多可在室溫固定,在低溫(4℃)時間應延長.

(4)固定容器應大些.

3.漂洗:流水衝洗2—10h.

4.脫水:從低濃度酒精到高濃度酒精.

70%(數分鍾)→80%(60-120’)→90%(60-120’)→95%(60-120’)→95%(60-120’)→100%(60-120’)→100%(60-120’).

5.透明:組織塊脫水後必須經過一種既能與酒精混合又能溶解石蠟的溶劑,而使石蠟進入組織塊.常用二甲苯,一般浸泡30m即可.

6.浸蠟:組織經透明後在熔化的石蠟內浸漬的過程稱浸蠟.一般需經2—3次浸漬才能完成,總時間為3—4h.用於浸蠟的石蠟熔點為52—56℃.

7.包埋:先將熔化的石蠟倒入包埋框再用加熱的鑷子將組織塊放入.包埋麵必須平整.包埋後石蠟稍凝後可移入冷水或冰箱中加速凝固.

8.切片:修塊→切片→展片→撈片→烤片.

也可作冰凍切片．

熒光染料的配製：

儲藏液：1mg/mldapi(DMSO、去離子水、pbs都可以溶解)

工作液：通常1μg/ml

染色時須避光，10min左右

用pbs衝去多餘染液即可觀察。