顯微鏡是觀察細胞的主要工具。根據光源不同，可分為光學顯微鏡和電子顯微鏡兩大類。前者以可見光（紫外線顯微鏡以紫外光）為光源，後者則以電子束為光源。

—、光學顯微鏡

（一）、普通光學顯微鏡

普通生物顯微鏡由3部分構成
，即：①照明係統，包括光源和聚光器；②光學放大係統
，由物鏡和目鏡組成，是顯微鏡的主體，為了消除球差和色差，目鏡和物鏡都由複雜的透鏡組構成；③機械裝置，用於固定材料和觀察方便（圖2-1）。

顯微鏡物象是否清楚不僅決定於放大倍數，還與顯微鏡的分辨力（resolution）有關，分辨力是指顯微鏡（或人的眼睛距目標25cm處）能分辨物體最小間隔的能力，分辨力的大小決定於光的波長和鏡口率以及介質的折射率，用公式表示為：

式中：n=介質折射率；α=鏡口角（標本對物鏡鏡口的張角），N.A.=鏡口率（numeric aperture）。鏡口角總是要小於180?，所以sina/2的最大值必然小於1。

製作光學鏡頭所用的玻璃折射率為1.65～1.78
，所用介質的折射率越接近玻璃的越好。對於幹燥物鏡來說，介質為空氣
，鏡口率一般為0.05～0.95；油鏡頭用香柏油為介質，鏡口率可接近1.5。

普通光線的波長為400～700nm
，因此顯微鏡分辨力數值不會小於0.2μm，人眼的分辨力是0.2mm，所以一般顯微鏡設計的最大放大倍數通常為1000X。

（二）
、熒光顯微鏡

細胞中有些物質，如葉綠素等
，受紫外線照射後可發熒光；另有一些物質本身雖不能發熒光
，但如果用熒光染料或熒光抗體染色後，經紫外線照射亦可發熒光
，熒光顯微鏡（圖2-2，3，4）就是對這類物質進行定性和定量研究的工具之一。

熒光顯微鏡和普通顯微鏡有以下的區別：

1
、照明方式通常為落射式，即光源通過物鏡投射於樣品上（圖2-3）；

2、光源為紫外光
，波長較短，分辨力高於普通顯微鏡；

3、有兩個特殊的濾光片，光源前的用以濾除可見光
，目鏡和物鏡之間的用於濾除紫外線，用以保護人目。

（三）、激光共聚焦掃描顯微鏡


 

激光共聚焦掃描顯微鏡（laser confocal scanning microscope

，圖2-5

、6）用激光作掃描光源
，逐點、逐行
、zhumiankuaisusaomiaochengxiang
，saomiaodejiguangyuyingguangshoujigongyongyigewujing
，wujingdejiaodianjisaomiaojiguangdejujiaodian，yeshishunshichengxiangdewudian。youyujiguangshudebochangjiaoduan，guangshuhenxi

，suoyigongjiaojiguangsaomiaoxianweijingyoujiaogaodefenbianli


，dayueshiputongguangxuexianweijingde3倍(bei)。係(xi)統(tong)經(jing)一(yi)次(ci)調(tiao)焦(jiao)，掃(sao)描(miao)限(xian)製(zhi)在(zai)樣(yang)品(pin)的(de)一(yi)個(ge)平(ping)麵(mian)內(nei)。調(tiao)焦(jiao)深(shen)度(du)不(bu)一(yi)樣(yang)時(shi)，就(jiu)可(ke)以(yi)獲(huo)得(de)樣(yang)品(pin)不(bu)同(tong)深(shen)度(du)層(ceng)次(ci)的(de)圖(tu)像(xiang)
，這(zhe)些(xie)圖(tu)像(xiang)信(xin)息(xi)都(dou)儲(chu)於(yu)計(ji)算(suan)機(ji)內(nei)，通(tong)過(guo)計(ji)算(suan)機(ji)分(fen)析(xi)和(he)模(mo)擬(ni)，就(jiu)能(neng)顯(xian)示(shi)細(xi)胞(bao)樣(yang)品(pin)的(de)立(li)體(ti)結(jie)構(gou)。

激光共聚焦掃描顯微鏡既可以用於觀察細胞形態，也可以用於細胞內生化成分的定量分析
、光密度統計以及細胞形態的測量。

（四）
、暗視野顯微鏡

暗視野顯微鏡（dark field microscope
，圖2-7）的de聚ju光guang鏡jing中zhong央yang有you當dang光guang片pian，使shi照zhao明ming光guang線xian不bu直zhi接jie進jin人ren物wu鏡jing，隻zhi允yun許xu被bei標biao本ben反fan射she和he衍yan射she的de光guang線xian進jin入ru物wu鏡jing，因yin而er視shi野ye的de背bei景jing是shi黑hei的de，物wu體ti的de邊bian緣yuan是shi亮liang的de。利li用yong這zhe種zhong顯xian微wei鏡jing能neng見jian到dao小xiao至zhi 4~200nm的微粒子

，分辨率可比普通顯微鏡高50倍。

（五）、相差顯微鏡

相差顯微鏡（phasecontrast microscope，圖2-8、9）由P．Zernike於1932年發明
，並因此獲1953年諾貝爾物理獎。這種顯微鏡最大的特點是可以觀察未經染色的標本和活細胞。

相(xiang)差(cha)顯(xian)微(wei)鏡(jing)的(de)基(ji)本(ben)原(yuan)理(li)是(shi)，把(ba)透(tou)過(guo)標(biao)本(ben)的(de)可(ke)見(jian)光(guang)的(de)光(guang)程(cheng)差(cha)變(bian)成(cheng)振(zhen)幅(fu)差(cha)
，從(cong)而(er)提(ti)高(gao)了(le)各(ge)種(zhong)結(jie)構(gou)間(jian)的(de)對(dui)比(bi)度(du)

，使(shi)各(ge)種(zhong)結(jie)構(gou)變(bian)得(de)清(qing)晰(xi)可(ke)見(jian)。光(guang)線(xian)透(tou)過(guo)標(biao)本(ben)後(hou)發(fa)生(sheng)折(zhe)射(she)，偏(pian)離(li)了(le)原(yuan)來(lai)的(de)光(guang)路(lu)，同(tong)時(shi)被(bei)延(yan)遲(chi)了(le)1/4λ（波長），如果再增加或減少1/4λ，則光程差變為1/2λ，兩束光合軸後幹涉加強，振幅增大或減下

，提高反差。在構造上，相差顯微鏡有不同於普通光學顯微鏡兩個特殊之處：

1、環形光闌（annular diaphragm）位於光源與聚光器之間
，作用是使透過聚光器的光線形成空心光錐，焦聚到標本上。

2、相位板（annular phaseplate）在物鏡中加了塗有氟化鎂的相位板，可將直射光或衍射光的相位推遲1/4λ。分為兩種：

①A+相板：將直射光推遲1/4λ，兩組光波合軸後光波相加，振幅加大
，標本結構比周圍介質更加變亮

，形成亮反差（或稱負反差）。

② B+相板：將衍射光推遲1/4λ，兩組光線合軸後光波相減，振幅變小，形成暗反差（或稱正反差）
，結構比周圍介質更加變暗。


 

（六）、偏光顯微鏡

偏光顯微鏡（polarizing microscope）用於檢測具有雙折射性的物質
，如纖維絲、紡錘體、膠原、染色體等等。和普通顯微鏡不同的是：其光源前有偏振片（起偏器），使進入顯微鏡的光線為偏振光，鏡筒中有檢偏器（一個偏振方向與起偏器垂直的的起偏器）

，這(zhe)種(zhong)顯(xian)微(wei)鏡(jing)的(de)載(zai)物(wu)台(tai)是(shi)可(ke)以(yi)旋(xuan)轉(zhuan)的(de)，當(dang)載(zai)物(wu)台(tai)上(shang)放(fang)入(ru)單(dan)折(zhe)射(she)的(de)物(wu)質(zhi)時(shi)，無(wu)論(lun)如(ru)何(he)旋(xuan)轉(zhuan)載(zai)物(wu)台(tai)，由(you)於(yu)兩(liang)個(ge)偏(pian)振(zhen)片(pian)是(shi)垂(chui)直(zhi)的(de)
，顯(xian)微(wei)鏡(jing)裏(li)看(kan)不(bu)到(dao)光(guang)線(xian)，而(er)放(fang)入(ru)雙(shuang)折(zhe)射(she)性(xing)物(wu)質(zhi)時(shi)

，由(you)於(yu)光(guang)線(xian)通(tong)過(guo)這(zhe)類(lei)物(wu)質(zhi)時(shi)發(fa)生(sheng)偏(pian)轉(zhuan)
，因(yin)此(ci)旋(xuan)轉(zhuan)載(zai)物(wu)台(tai)便(bian)能(neng)檢(jian)測(ce)到(dao)這(zhe)種(zhong)物(wu)體(ti)。

（七）、微分幹涉差顯微鏡

1952年，Nomarski在相差顯微鏡原理的基礎上發明了微分幹涉差顯微鏡（differential interference contrast microscope）。DIC顯微鏡又稱Nomarski相差顯微鏡（Nomarki contrast microscope），其優點是能顯示結構的三維立體投影影像。與相差顯微鏡相比，其標本可略厚一點
，折射率差別更大，故影像的立體感更強。

DIC顯微鏡的物理原理完全不同於相差顯微鏡，技術設計要複雜得多。DIC利用的是偏振光
，有四個特殊的光學組件：偏振器（polarizer）
、DIC棱鏡
、DIC滑行器和檢偏器（analyzer）。偏振器直接裝在聚光係統的前麵
，使光線發生線性偏振。在聚光器中則安裝了石英Wollaston棱鏡

，即DIC棱鏡
，此棱鏡可將一束光分解成偏振方向不同的兩束光（x和y），二(er)者(zhe)成(cheng)一(yi)小(xiao)夾(jia)角(jiao)。聚(ju)光(guang)器(qi)將(jiang)兩(liang)束(shu)光(guang)調(tiao)整(zheng)成(cheng)與(yu)顯(xian)微(wei)鏡(jing)光(guang)軸(zhou)平(ping)行(xing)的(de)方(fang)向(xiang)。最(zui)初(chu)兩(liang)束(shu)光(guang)相(xiang)位(wei)一(yi)致(zhi)
，在(zai)穿(chuan)過(guo)標(biao)本(ben)相(xiang)鄰(lin)的(de)區(qu)域(yu)後(hou)，由(you)於(yu)標(biao)本(ben)的(de)厚(hou)度(du)和(he)折(zhe)射(she)率(lv)不(bu)同(tong)，引(yin)起(qi)了(le)兩(liang)束(shu)光(guang)發(fa)生(sheng)了(le)光(guang)程(cheng)差(cha)。在(zai)物(wu)鏡(jing)的(de)後(hou)焦(jiao)麵(mian)處(chu)安(an)裝(zhuang)了(le)第(di)二(er)個(ge)Wollaston棱鏡，即DIC滑行器，它把兩束光波合並成一束。這時兩束光的偏振麵（x和y）仍然存在。最後光束穿過第二個偏振裝置，即檢偏器。在光束形成目鏡DIC影像之前

，檢偏器與偏光器的方向成直角。檢偏器將兩束垂直的光波組合成具有相同偏振麵的兩束光
，從而使二者發生幹涉。x和y波的光程差決定著透光的多少。光程差值為0時，沒有光穿過檢偏器；光guang程cheng差cha值zhi等deng於yu波bo長chang一yi半ban時shi，穿chuan過guo的de光guang達da到dao最zui大da值zhi。於yu是shi在zai灰hui色se的de背bei景jing上shang

，標biao本ben結jie構gou呈cheng現xian出chu亮liang暗an差cha。為wei了le使shi影ying像xiang的de反fan差cha達da到dao最zui佳jia狀zhuang態tai，可ke通tong過guo調tiao節jieDIC滑行器的縱行微調來改變光程差
，光程差可改變影像的亮度。調節DIC滑(hua)行(xing)器(qi)可(ke)使(shi)標(biao)本(ben)的(de)細(xi)微(wei)結(jie)構(gou)呈(cheng)現(xian)出(chu)正(zheng)或(huo)負(fu)的(de)投(tou)影(ying)形(xing)象(xiang)，通(tong)常(chang)是(shi)一(yi)側(ce)亮(liang)，而(er)另(ling)一(yi)側(ce)暗(an)，這(zhe)便(bian)造(zao)成(cheng)了(le)標(biao)本(ben)的(de)人(ren)為(wei)三(san)維(wei)立(li)體(ti)感(gan)
，類(lei)似(si)大(da)理(li)石(shi)上(shang)的(de)浮(fu)雕(diao)（圖2-10）。

DIC顯微鏡使細胞的結構
，特別是一些較大的細胞器，如核、線粒體等
，立體感特別強
，適合於顯微操作。目前像基因注入、核移植、轉基因等的顯微操作常在這種顯微鏡下進行。

（八）、倒置顯微鏡

組成和普通顯微鏡一樣
，隻不過物鏡與照明係統顛倒，前者在載物台之下，後者在載物台之上（圖2-11）
，用於觀察培養的活細胞，具有相差物鏡。

進入20世紀80年(nian)代(dai)以(yi)來(lai)，光(guang)學(xue)顯(xian)微(wei)鏡(jing)的(de)設(she)計(ji)和(he)製(zhi)作(zuo)又(you)有(you)了(le)很(hen)大(da)的(de)發(fa)展(zhan)，其(qi)發(fa)展(zhan)趨(qu)勢(shi)主(zhu)要(yao)表(biao)現(xian)在(zai)，注(zhu)重(zhong)實(shi)用(yong)性(xing)和(he)多(duo)功(gong)能(neng)方(fang)麵(mian)的(de)改(gai)進(jin)。在(zai)裝(zhuang)配(pei)設(she)計(ji)上(shang)趨(qu)於(yu)采(cai)用(yong)組(zu)合(he)方(fang)式(shi)，集(ji)普(pu)通(tong)光(guang)鏡(jing)加(jia)相(xiang)差(cha)

、熒光、暗視野、DIC
、攝影裝置於一體
，從而操作靈活，使用方便。

二、電子顯微鏡

（一）、透射電子顯微鏡

1、基本原理

在光學顯微鏡下無法看清小於0.2?m的細微結構，這些結構稱為亞顯微結構（submicroscopic structures）或超微結構（ultramicroscopic structures

；ultrastructures）。要想看清這些結構，就必須選擇波長更短的光源，以提高顯微鏡的分辨率。1932年Ruska發明了以電子束為光源的透射電子顯微鏡（transmission electron microscope，TEM），電子束的波長要比可見光和紫外光短得多，並且電子束的波長與發射電子束的電壓平方根成反比
，也就是說電壓越高波長越短。目前TEM的分辨力可達0.2nm。

電子顯微鏡（圖2-12）與yu光guang學xue顯xian微wei鏡jing的de成cheng像xiang原yuan理li基ji本ben一yi樣yang，所suo不bu同tong的de是shi前qian者zhe用yong電dian子zi束shu作zuo光guang源yuan
，用yong電dian磁ci場chang作zuo透tou鏡jing。另ling外wai

，由you於yu電dian子zi束shu的de穿chuan透tou力li很hen弱ruo
，因yin此ci用yong於yu電dian鏡jing的de標biao本ben須xu製zhi成cheng厚hou度du約yue50nm左右的超薄切片。這種切片需要用超薄切片機（ultramicrotome）製作。電子顯微鏡的放大倍數最高可達近百萬倍
、由電子照明係統
、電磁透鏡成像係統

、真空係統

、記錄係統、電源係統等5部分構成。


 

2
、製樣技術

1）超薄切片

通常以鋨酸和戊二醛固定樣品
，以環氧樹脂包埋，以熱膨脹或螺旋推進的方式推進樣品切片（圖2-13）
，切片厚度20~50nm，切片采用重金屬鹽染色，以增大反差（圖2-14）。




 

2）負染技術

負染就是用重金屬鹽（如磷鎢酸、醋酸雙氧鈾）對鋪展在載網上的樣品進行染色；吸去染料，樣品幹燥後，樣品凹陷處鋪了一薄層重金屬鹽，而凸的出地方則沒有染料沉積，從而出現負染效果（圖2-15），分辨力可達1.5nm左右。

3）冰凍蝕刻

冰凍蝕刻（freeze-etching）亦稱冰凍斷裂（freeze-fracture）。標本置於-100?C的幹冰或-196?C的液氮中，進行冰凍。然後用冷刀驟然將標本斷開，升溫後，冰在真空條件下迅即升華
，暴露出斷麵結構，稱為蝕刻（etching）。蝕刻後，向斷麵以45度角噴塗一層蒸汽鉑
，再以90度角噴塗一層碳，加強反差和強度。然後用次氯酸鈉溶液消化樣品，把碳和鉑的膜剝下來，此膜即為複膜（replica）。複膜顯示出了標本蝕刻麵的形態

，在電鏡下得到的影像即代表標本中細胞斷裂麵處的結構（圖2-16）。

（二）、掃描電子顯微鏡

掃描電子顯微鏡（scanning electron microscope
，SEM，圖2-17
、18

、19）於20世紀60niandaiwenshi
，yonglaiguanchabiaobendebiaomianjiegou。qigongzuoyuanlishiyongyishujixidedianzishusaomiaoyangpin，zaiyangpinbiaomianjifachucijidianzi

，cijidianzideduoshaoyudianzishurushejiaoyouguan，yejiushishuoyuyangpindebiaomianjiegouyouguan

，cijidianziyoutancetishouji
，bingzainalibeishanshuoqizhuanbianweiguangxinhao，zaijingguangdianbeizengguanhefangdaqizhuanbianweidianxinhaolaikongzhiyingguangpingshangdianzishudeqiangdu

，xianshichuyudianzishutongbudesaomiaotuxiang。tuxiangweilitixingxiang
，fanyinglebiaobendebiaomianjiegou。weileshibiaobenbiaomianfashechucijidianzi，biaobenzaiguding

、脫水後

，要噴塗上一層重金屬微粒，重金屬在電子束的轟擊下發出次級電子信號。

目前掃描電鏡的分辨力為6～10nm，人眼能夠區別熒光屏上兩個相距0.2mm的光點，則掃描電鏡的最大有效放大倍率為0.2mm/10nm=20000X。

（三）、掃描隧道顯微鏡

掃描隧道顯微鏡（scanning tunneling microscope

，STM）由Binnig等1981nianfaming，genjuliangzilixueyuanlizhongdesuidaoxiaoyingersheji。dangyuanzichidudezhenjianzaibudaoyigenamidegaodushangsaomiaoyangpinshi，cichudianziyunzhongdie，waijiayidianya（2mV～2V），針zhen尖jian與yu樣yang品pin之zhi間jian產chan生sheng隧sui道dao效xiao應ying而er有you電dian子zi逸yi出chu
，形xing成cheng隧sui道dao電dian流liu。電dian流liu強qiang度du和he針zhen尖jian與yu樣yang品pin間jian的de距ju離li有you函han數shu關guan係xi
，當dang探tan針zhen沿yan物wu質zhi表biao麵mian按an給gei定ding高gao度du掃sao描miao時shi，因yin樣yang品pin表biao麵mian原yuan子zi凹ao凸tu不bu平ping
，使shi探tan針zhen與yu物wu質zhi表biao麵mian間jian的de距ju離li不bu斷duan發fa生sheng改gai變bian，從cong而er引yin起qi電dian流liu不bu斷duan發fa生sheng改gai變bian。將jiang電dian流liu的de這zhe種zhong改gai變bian圖tu像xiang化hua即ji可ke顯xian示shi出chu原yuan子zi水shui平ping的de凹ao凸tu形xing態tai。掃sao描miao隧sui道dao顯xian微wei鏡jing的de分fen辨bian率lv很hen高gao，橫heng向xiang為wei0.1～0.2nm，縱向可達0.001nm。它的優點是三態（固態、液態和氣態）物質均可進行觀察
，而普通電鏡隻能觀察製作好的固體標本。

利用掃描隧道顯微鏡直接觀察生物大分子，如DNA、RNA和蛋白質等分子的原子布陣，和某些生物結構，如生物膜、細胞壁等的原子排列。

三、顯微操作技術

顯微操作技術（micromanipulation technique）是指在高倍複式顯微鏡下，利用顯微操作器（micromanipulator，圖2-20）進行細胞或早期胚胎操作的一種方法。顯微操作器是用以控製顯微注射針在顯微鏡視野內移動的機械裝置。

顯微操作技術包括細胞核移植、顯微注射、嵌合體技術、胚胎移植以及顯微切割等。細胞核移植技術已有幾十年的曆史，Gordon等人（1962）對非洲爪蟾進行核移植獲得成功。我國著名學者童第周等在魚類細胞核移植方麵進行了許多工作，並取得了豐碩成果