無菌驗證分為設備檢查、煙霧測試和塵埃粒子測試
、染色試驗、輔助係統測試、正壓罩環境預測試
、貼片實驗、瓶內

、外挑戰測試、蓋內、外挑戰測試、LG培養基預測試、產品測試及LG培養基測試十一步。本文會對瓶內、外挑戰測試和蓋內、外挑戰測試及LG培養基測試三大部分重點討論。

試驗前準備工作
，需確保包裝物和產品初始菌含量滿足要求：

瓶子(新吹的)：<3CFU/瓶內和瓶外；

瓶蓋：<20 CFU / 蓋
；

產品：<100 CFU / ml營養菌；

            < 10 CFU / ml耐熱孢子；

工藝水：< 50 CFU / 250 ml。

包裝容器

空瓶：保證平均滅菌率為log6
，是指在瓶子的內部和瓶蓋消毒接種杆狀菌作為初始帶菌量。整個步驟如下：使用移液槍向130個瓶子接種枯草芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus ATCC 9372)孢子懸浮液(載量：每毫升0.1ml/10⁷CFU )並幹燥(8到24小時)。注意此處菌體和芽孢數量會隨時間和溫度損失。

120個瓶子由灌裝機灌注無菌水瓶並由旋蓋機封蓋(以下簡稱“測試樣”)，10個瓶子用於檢測初始帶菌量(以下簡稱“陽性對照樣”) (為了防止菌體數量過度損失，建議接種濃度要高1個log)。采用端點方法計算-過膜過濾方法確認枯草芽孢杆菌孢子進行評估。結果隻受目標菌影響。

瓶內挑戰測試：

①選取260個以上完好空瓶
；

②用枯草芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus ATCC 9372)孢子懸浮液接種空瓶：10⁵和10⁶各130瓶，接種位置依瓶型而定，但盡量選擇瓶內凹陷不易殺菌的地方
，並充分震蕩
；

③kongpingzhengchangfengganhouzhunbeijinxingceshi

，yizuigaoshengchansudu，quebaozuiduanshijianyenengdadaomiejunyaoqiu
，xiandinongduzaigaonongdu
，xitongxuyuxiantiaoshihao
，wujunguanzhongzhunbeihaowujunshui；

④測試前隨機抽取10⁵的10個空瓶到實驗室進行陽性對照檢查，其方法為
，到實驗室將空瓶灌裝100ml無菌水（預先加入吐溫80輔助洗脫），蓋上無菌瓶蓋（預先去除防盜環並用鋁箔紙包好的經121℃*15min濕熱滅菌後的瓶蓋），充分振蕩清洗
，然後進行梯度稀釋，至少稀釋5個梯度
，取合適濃度的兩個梯度樣品，各取1ml進行倒平板，每梯度樣品做2~3個平行，依GB 4789.2-2016菌落總數混釋法進行實驗計數，得出空瓶的初始帶菌量；

⑤將120個10⁵空瓶手動放入輸送帶進行殺菌

、洗瓶
、灌裝（灌裝100ml無菌水
，根據瓶型，為維持設備運轉穩定性，可以適當提高灌裝量）、封蓋，另120個10⁶空瓶重複以上操作
；

⑥將灌裝好的產品在實驗室充分振蕩後進行膜過濾培養48小時後得出空瓶殺菌後殘留帶菌量
，注意跟陽性對照實驗室區分開；

瓶外挑戰測試：

①選取130個以上完好空瓶；

②用枯草芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus ATCC 9372)孢子懸浮液接種空瓶：10⁴和10⁵各65瓶，接種位置依瓶型而定
，但盡量選擇瓶外凹陷不易殺菌的地方，接種後用記號筆在接種部位做好標識；

③空瓶正常風幹後準備進行測試，手動掛到輸送帶進行測試；

④測試前隨機抽取10⁴的5個空瓶到實驗室進行陽性對照檢查，其方法為：到實驗室將空瓶接種位置剪開，放入已滅菌好的100ml無菌水的盒子中充分振蕩清洗，然後進行梯度稀釋
，至少稀釋4個梯度，得出空瓶外部初始帶菌量；

⑤將60個10⁴空瓶經過正常的殺菌程序後，灌裝出口放置一次性無菌取樣袋。取出空瓶後
，到實驗室將接種標識位置剪出，放入已滅菌的100ml無菌水的盒子中充分振蕩清洗後進行膜過濾，或用已滅菌的棉簽來塗抹接種標識位置，將棉簽放入已滅菌的100ml無菌水的盒子中充分振蕩清洗後進行膜過濾
，從而得出瓶外殺菌後殘留帶菌量。另60個10⁵空瓶重複以上操作；

驗證判定：用陽性對照檢測的含菌量與殺菌後殘留的菌量進行對照
，從而判定殺菌力（衰減計數法），帶入以下公式：

Log(Rave ) =Log(∑Rc/Nsample)- Log(∑Sc/Ntest)

∑Rc：陽性對照樣帶菌總數；

Nsample：陽性對照樣數量；

∑Sc：測試樣殘留帶菌總數；

Ntest：測試樣數量
；

Log(Rmin ) =Log(∑Rc/Nsample)- Log(Sc)

Sc：測試樣的殘留帶菌數最大樣品的菌落數；

Log(Rmin )：最低殺菌能力

瓶蓋：采用與瓶子相似的方法對瓶蓋(注意瓶蓋應外觀良好
，此處排除斷環等情況)接種。我們隻對與產品接觸的瓶蓋部分進行接種-螺紋線除外。接種60個瓶蓋作為取樣，10個瓶蓋用於檢測初始帶菌量。瓶蓋通過旋蓋機應用到灌裝了無菌水的瓶子上。通過端點方法計算-過膜過濾方法確認枯草芽孢杆菌孢子進行評估。結果隻受目標菌影響。

蓋內挑戰測試：

①選取130個以上完好瓶蓋
；

②用枯草芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus ATCC 9372)孢子懸浮液接種瓶蓋：10⁵和10⁶各65個；

③瓶ping蓋gai正zheng常chang風feng幹gan後hou準zhun備bei進jin行xing測ce試shi
，以yi最zui高gao生sheng產chan速su度du，確que保bao最zui短duan時shi間jian也ye能neng達da到dao滅mie菌jun要yao求qiu
，先xian低di濃nong度du再zai高gao濃nong度du，係xi統tong需xu預yu先xian調tiao試shi好hao，無wu菌jun罐guan中zhong準zhun備bei好hao無wu菌jun水shui；

④測試前隨機抽取10⁵的5個瓶蓋到實驗室進行陽性對照檢查，其方法為

，到實驗室將瓶蓋分別放入裝有100ml無菌水（預先加入吐溫80輔助洗脫）的盒子中，充分振蕩清洗，然後進行梯度稀釋，至少稀釋5個梯度，取合適濃度的兩個梯度樣品，各取1ml進行倒平板，每梯度樣品做2~3個平行，依GB 4789.2-2016菌落總數混釋法進行實驗計數，得出蓋內的初始帶菌量；

⑤將60個10⁵瓶蓋手動放入蓋整列機（接種蓋子和未接種蓋子用兩種顏色進行區分）
，進行殺菌、衝洗、吹幹、封蓋
，另60個10⁶瓶蓋重複以上操作；

⑥將封蓋後的產品（灌裝100ml無菌水，根據瓶型
，為維持設備運轉穩定性，可以適當提高灌裝量）在實驗室充分振蕩後，進行膜過濾
，旋開的瓶蓋也放入濾杯中進行衝洗過濾，依GB 4789.2-2016菌落總數混釋法進行實驗計數，得出蓋內的殺菌後殘留帶菌量；

蓋外挑戰測試：

①選取70個以上完好瓶蓋；

②用枯草芽孢杆菌(Bacillus atrophaeus ATCC 9372)孢子懸浮液接種空瓶：10⁴和10⁵各35個，接種位置盡量選擇蓋外不易殺菌點，接種後用記號筆在接種部位做好標識；

③瓶蓋正常風幹後準備進行測試，手動放入蓋整列機（接種蓋子和未接種蓋子用兩種顏色進行區分），進行殺菌、衝洗、吹幹
、封蓋
，另35個10⁵瓶蓋重複以上操作；

④測試前隨機抽取10⁴的5個瓶蓋到實驗室進行陽性對照檢查，其方法為
，到實驗室將瓶蓋分別放入裝有100ml無菌水（預先加入吐溫80輔助洗脫）的盒子中
，充分振蕩清洗，然後進行梯度稀釋，至少稀釋4個梯度，取合適濃度的兩個梯度樣品，各取1ml進行倒平板，每梯度樣品做2~3個平行
，依GB 4789.2-2016菌落總數混釋法進行實驗計數，得出蓋外的初始帶菌量
；

⑤將30個10⁴瓶蓋手動放入蓋整列機（接種蓋子和未接種蓋子用兩種顏色進行區分），進行殺菌、衝洗、吹幹、封蓋，灌裝出口處用一次性無菌取樣袋取樣。到實驗室將瓶蓋旋開，放入已滅菌的100mlwujunshuidehezizhongchongfenzhendangqingxihoujinxingmoguolv
，huoyongyicixingwujunquyangdaizhijiezaifenggaiqiandexiagaiguidaochudangequyang，ranhoudaoshiyanshijianggaiquchu
，zhijiefangruyimiejunde100ml無(wu)菌(jun)水(shui)的(de)盒(he)子(zi)中(zhong)充(chong)分(fen)振(zhen)蕩(dang)清(qing)洗(xi)後(hou)進(jin)行(xing)膜(mo)過(guo)濾(lv)
，也(ye)可(ke)以(yi)將(jiang)無(wu)菌(jun)水(shui)直(zhi)接(jie)倒(dao)入(ru)無(wu)菌(jun)取(qu)樣(yang)袋(dai)中(zhong)，清(qing)洗(xi)後(hou)進(jin)行(xing)膜(mo)過(guo)濾(lv)，從(cong)而(er)得(de)出(chu)蓋(gai)外(wai)殺(sha)菌(jun)後(hou)殘(can)留(liu)帶(dai)菌(jun)量(liang)。另(ling)30個10⁵瓶蓋重複以上操作
；

蓋內外的驗證判定方法和瓶內外的方法相同。

無菌環境和無菌介質

無菌水：對無菌水製備裝置進行微生物檢測，使用PCA和OSA對無菌水進行關於飲料有害菌的微生物檢測，以驗證其無菌性。無菌水用於：瓶蓋浸泡消毒
、無菌衝瓶機、瓶口衝洗及外部SIP前後的衝水(噴衝消毒)。另外，熱水殺菌過程被檢測
，包括設定的溫度，壓力和熱滯留時間。121℃作為SIP回管的溫度為前提條件。

無菌水無菌程度的檢驗要在采用正確的殺菌後在無菌水供給的各個端口檢測：如瓶蓋消毒係統
，衝瓶機機組，瓶蓋螺旋線的衝洗係統，設備外部自消毒所用的無菌水（在前麵的外部自清洗後進行）。

無菌空氣：在使用無菌空氣的機器上（灌裝機，衝瓶機，旋蓋的螺旋線消毒裝置，瞬時殺菌機的緩衝罐）必須對無菌空氣（通過取樣閥）的無菌性進行檢測。

預測試：每次測試最小10,000瓶。灌裝量均為半灌裝。

為了給在瓶子中可能存在的細菌足夠的生長時間並避免取樣錯誤
，一定數量的經過灌裝和封蓋的的樣品要在30℃的溫度下預保存3天。

無菌驗證

無菌驗證既低酸產品微生物確認和驗收測試，可以深入了解工藝流程和灌裝線的微生物狀況。

低酸飲料（PH＞4.5;奶、奶飲料和非碳酸天然礦泉水除外）商業殺菌率為：

1: 10,000 [pH > 4,5]

在10,000個灌裝的瓶子中，感染擴增飲料有害菌的不多於1瓶。通常認證采用linden grain來替代低酸產品。

在驗收生產過程中經過在30~35℃溫度下儲存14天後獲得上述殺菌率
，即認為被證實有效並完成。

產品測試：LG培養基須經UHT138℃×32s滅菌或灌裝，驗收生產運行72小時，且在連續的3天中進行。將從生產中逐步提取30,000個瓶子(開機5,000瓶
，第24小時後提取5,000瓶，第48小時後提取8,000個，第72小時後提取10,000個，無菌率為每批：1:10,000 或總量：3:30,000)。其中，最後一步的取樣將按如下方式進行：生產72小時後，依次打開隔離罩破壞無菌環境(3分鍾-3扇窗-每扇窗打開1分鍾, 選擇灌裝機和衝瓶機的窗子)。經過SOP(時間≤15分鍾)後
，開始生產
，再取另外2,000瓶)。合計30,000瓶全部半瓶灌裝。待機時每間隔4小時進行短時SOP。將這些瓶子至於30~35℃儲存3天之後
，在光源下對儲存的瓶子作視覺檢驗
，以驗證微生物影響(混濁、菌絲生長)。全檢後將這些瓶子倒置，7天後進行再次全檢，如無異常
，14天後再進行全檢。