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結論:反複凍融會降低菌種的存活率.
中圖分類號:R378.21; Q93-336
微生物菌種的保存方法因微生物種類不同而有所不同,國內外對此有較多的報道[1～3].甘油保存法是生產中常用的方法之一.在甘油保存菌種過程中,細胞內外形成的冰晶會對細胞造成結構上的損傷,從而影響菌種的存活率.本文主要探討了反複凍融對發酵用大腸杆菌甘油保存的影響.為製藥和微生物工作者提供具有參考價值的數據.
1.材料
大腸杆菌PJLA605-HIL2.
LB固體培養基:胰蛋白腖(英國Oxoid)10 g、酵母抽提物(英國 Oxoid)5 g,氯化鈉10 g,溶解並定容至1 000 ml,調pH至7.2,固體培養基加2%瓊脂.
2.方法和結果
2.1大腸杆菌培養
將待分離的菌種劃LB平板,以取得單菌落,經模擬發酵選出優良菌種,將此菌種接到LB斜麵上,30℃,培養24 h.
2.2大腸杆菌凍存
用10%甘油溶液洗下培養好的菌種,並在無菌小燒杯中混勻,製成濃度為1×108個/ml的菌懸液,然後分裝到eppendorf管中,每支eppendorf管加菌液1 ml,將此菌種分成3組,編號1、2、3,然後放入-20℃冰箱中保存.
2.3二次凍存
將2.2項中的第2、3組菌種從-20℃冰箱中取出,於28℃～30℃的水浴鍋中融化,然後再放入-20℃冰箱凍存.
2.4三次凍存
將2.3項中的第3組菌種從-20℃冰箱中取出,於28℃～30℃的水浴鍋中融化,然後再放入-20℃冰箱凍存.
2.5存活率的測定
采用平板菌落計數法.取LB平板9套,每3套為一組,在每組皿底分別標明10-7、10-8、10-9,再取9個2 ml西林瓶,依次標明10-1、10-2、10-3……10-9,並向西林瓶中各加入無菌水0.9 ml.
用微量取樣器精確吸取第1組菌液0.1 ml注入10-1西林瓶中.將10-1西林瓶內的菌液混勻,即成10-1稀釋液.再從10-1西林瓶中取稀釋液0.1 ml注入10-2西林瓶中,重複上述操作,直至製成10-7、10-8、10-9稀釋液.
分別精確取10-7、10-8、10-9稀釋液0.1 ml注入對應的LB平板內,用玻璃塗布器塗布均勻,於30℃培養24 h後,數各皿中的菌落數,計算出同一稀釋度3個平皿上菌落的平均數,根據菌落數計數活菌數.
用同樣步驟可計算出冷凍前3組菌液的活菌數,見表1.
在冷凍後及冷凍後1年、2年分別將3組菌種從-20℃冰箱中取出,於28℃～30℃水浴鍋中融化,用平板計數法測定活菌數,計算菌種存活率,如表1.
3.討論
在冷凍保存菌種時加入甘油作保護劑,雖然可以提高菌種的存活率,但凍融還是會造成菌體結構上的損傷.菌種每凍融一次,其存活率都會明顯下降,經處理後的菌種保存1年或2年後,凍融次數越多,其存活率越低.因此,為使菌種有較高的存活率,不宜反複凍融.生產用甘油菌種一般保存1年,對1年後的菌種就要對其篩選活化後再用.
參考文獻
1,王亞珍.乳酸杆菌的保藏方法.生物技術,1998,8(1)∶41～42
2,李廣武,鄭從義,唐兵.低溫生物學.長沙∶湖南科學技術出版社,1998∶130～131
3,中國科學院微生物研究所菌種保藏手冊編著組.菌種保藏手冊.北京∶科學出版社,1980∶649～652
