土黴素,金黴素,四環素

 

2、 儀器設備:

    帶熒光檢測器的高效液相色譜儀,

 

3、 試劑:

    除下列試劑外,使用附錄2所列試劑,

    咪唑:特級

    咪唑緩衝溶液:將68.08g咪唑、0.37g EDTA 和10.72g乙酸鎂溶解在800mL水中,用乙酸調節pH7.2後,加水至1,000mL,

    含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩衝溶液:第1液:將21.0g檸檬酸溶解在水中至1,000mL,第2液:將71.6g磷酸氫二鈉溶解在水中至1,000mL,在1.86g乙二胺四乙酸中加入307mL第1液和193mL第2液混合的溶液溶解,

    苯乙烯二乙烯苯共聚物小柱 (265mg):在內徑8～9mm 聚乙烯管中填充265mg柱色譜用苯乙烯二乙烯苯共聚物或具有同等分離特性的物質,

 

4
、 標準品:

    鹽酸土黴素:本品1.000mg 含有土黴素0.850mg以上效價,分解點為190℃～194℃,

    鹽酸金黴素:本品1.000mg含有鹽酸金黴素0.900mg以上效價,分解點為210℃以上,

    鹽酸四環素:本品1.000mg 含有鹽酸四環素0.900mg以上效力,分解點為214℃以上,

 

5、 試驗溶液的製備:

    A．提取方法:

①肌肉、肝髒和腎髒

    肌肉:盡可能除去脂肪層,攪碎混合均勻後,稱取其5.00g,

    肝髒和腎髒:攪碎混合均勻後,稱取其5.00g,

    加入30mL含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩衝溶液,攪拌1分鍾後,以每分鍾3000轉離心分離10分鍾,水層移入100mL分液漏鬥中,離心分離管的殘留物中 加入20mL含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩衝溶液,用振蕩器激烈振蕩1分鍾後,按上述同樣條件離心分離,合並水層於上述分液漏鬥中,加入20mL正己 烷, 用振蕩器激烈振蕩5分鍾後,以每分鍾3000轉離心分離10分鍾,分取水層,

②脂肪

    脂肪:盡可能除去肌肉層,攪碎混合均勻後,稱取其20.0g,

    加入200mL正己烷,攪拌1分鍾後,加入40mL含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩衝溶液,再攪拌1分鍾後,以每分鍾3000轉離心分離10分鍾,分取水層,正 己烷層中加入20mL含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩衝溶液,用振蕩器激烈振蕩1分鍾後,按上述同樣條件離心分離,分取水層,合並於先分取的水層中,

③奶

    稱取5.00g樣品,加入30mL含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩衝溶液和20mL正己烷,用振蕩器激烈振蕩5分鍾後,以每分鍾3000轉離心分離10分鍾,分取水層,

④蛋

    除去蛋殼,充分均勻後,稱取其5.00g,加入30mL含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩衝溶液,均勻後,加入100mL正己烷,攪拌1分鍾後,以每分鍾3000 轉離心分離10分鍾,水層移入100mL分液漏鬥中,離心管的殘留物中加入20mL含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩衝溶液,用振蕩器激烈振蕩1分鍾後,按上述 同樣條件離心分離,合並水層於分液漏鬥中,加入20mL正己烷, 用振蕩器振蕩5分鍾後,以每分鍾3000轉離心分離10分鍾,分取水層,

⑤魚貝類

    有殼貝類:除去殼,攪碎混合均勻後,稱取其5.00g,

    其它的魚貝類:攪碎混合均勻後,稱取其5.00g,

    加入30mL含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩衝溶液,攪拌1分鍾後,以每分鍾3000轉離心分離10分鍾,水層移入100mL分液漏鬥中,離心管的殘留物中加入20mL含有乙二胺四乙酸的檸檬酸緩衝溶液,用振蕩器激烈振蕩1分鍾後,按上述同樣條件離心分離,合並水層於分液漏鬥中,加入20mL正己烷, 用振蕩器 激烈振蕩5分鍾後,以每分鍾3000轉離心分離10分鍾,分取水層,

  B．淨化方法:

    在苯乙烯二乙烯苯共聚物小柱（265mg）中,順次注入 10mL甲醇、10mL水和5mL飽和EDTA溶液,棄去流出液,柱中注入a提取方法所得的溶液後,注入10mL水,棄去流出液,注入10mL甲醇,收集 流出液於磨口減壓濃縮器中,40℃以下除去甲醇,殘留物中加入1.0mL 1.36％磷酸二氫鉀溶液溶解,此為試驗溶液,

 

6
、操作方法:

  A．定性試驗

    按下列操作條件進行試驗,試驗結果必須與標準品的一致,

    操作條件:

    柱填充劑:十八烷基甲矽烷基化矽膠(粒度5μm),

    柱:內徑4.0～6.0mm,長150mm不鏽鋼管,

    柱溫: 40℃

    檢測器:激發波長380nm,發射波長520nm,

    流動相:土黴素和四環素試驗時,用咪唑緩衝溶液:甲醇(17:3)的混合溶液,調整流速使土黴素約5分鍾流出,

    金黴素試驗時,用咪唑緩衝溶液:甲醇(3:1)的混合溶液,調整流速使金黴素約7分鍾流出,

B．定量試驗

    根據與A定性試驗相同操作條件所得的試驗結果,峰高法或峰麵積法定量,

 

7、定量限:

  A．肌肉,肝髒,腎髒,奶,蛋和魚貝類

    土黴素:0.02mg/kg

    金黴素:0.03mg/kg

    四環素:0.02mg/kg

  B．脂肪

    土黴素:0.005 mg/kg

 

8
、注意事項:

  (1)試驗溶液的製備:

①離心分離溫度保持在室溫,

②抽濾後濾液混濁時,濾液再次進行離心分離,

③在苯乙烯/二乙烯苯共聚物柱色譜中,注入試驗溶液後,30mL水分數次加入效果較好地洗浄柱中殘留的乙二胺四乙酸,

  (2)標準溶液的配製:

①稱取相當於10.0mg土黴素的標準品,溶解在甲醇中至10mL,作為土黴素的標準原液（土黴素1,000mg（效價）／L,1,000mg／L）,本標準原液保存在-20℃,1年內穩定,

②稱取相當於10.0mg金黴素的標準品,溶解在甲醇中至10mL,作為金黴素的標準原液（金黴素1,076mg（效價）／L,1,000mg／L）,本標準原液保存在-20℃,1年內穩定,

③稱取相當於10.0mg四環素的標準品,溶解在甲醇中至10mL,作為四環素的標準原液（四環素1,082mg（效力）／L,1,000mg／L）,本標準原液保存在-20℃,1年內穩定,

④用1.36%磷酸二氫鉀溶液將土黴素,金黴素和四環素各標準原液遞減稀釋,作為製作標準曲線用的標準溶液,

  (3)其它:

①同時進行很多樣品試驗的篩選試驗法提高判斷効率時,用「土黴素,金黴素和四環素的篩選法（參照117 頁）」判斷為陽性的,不妨用本檢測方法實施試驗,

②使用本檢測方法檢出土黴素,金黴素和四環素時,最好用帶質量檢測器的高效液相色譜儀確證.