分光光度法是指應用分光光度計的分析方法
，因其具有靈敏

、準確
、kuaisujixuanzexinghaodengtedianbeiguangfanyingyongyushiyanshideyuansufenxi，fenguangguangdujideshiyongsuiranjiandan
，danshiqiyuanlijiyixiejichuzhishixiangbiyouxuduoxiaohuobanyeshibulejiede，jintianxiaobianzhenglileyibufenfenxianggeidajia，xiwangnengduiniyousuobangzhu。

1原理

1、物質對光的選擇性吸收
當光束照射到物質上時，光與物質發生相互作用，產生反射、散射、吸收或透射。若被照射的是均勻溶液，光的散射可以忽略。

（1）溶液顏色的產生
當一束白光通過某一有色溶液時，一些波長的光被溶液吸收
，另ling一yi些xie波bo長chang的de光guang則ze透tou過guo溶rong液ye。透tou射she光guang或huo反fan射she光guang刺ci激ji人ren眼yan使shi人ren感gan到dao顏yan色se的de存cun在zai。人ren把ba自zi身shen能neng感gan覺jiao到dao的de光guang定ding義yi為wei可ke見jian光guang。在zai可ke見jian光guang區qu
，不bu同tong波bo長chang的de光guang呈cheng現xian不bu同tong的de顏yan色se，因yin此ci溶rong液ye的de顏yan色se由you透tou射she光guang的de波長所決定。透射光與吸收光可組成白光，故稱這兩種光互為補色光，兩種顏色互為補色。
（2）光吸收的本質
當一束光照射到某物質或其溶液時，組成該物質的分子、原子或離子與光子發生“碰撞”，光子的能量就轉移到分子、原子或離子上，是這些粒子由最低能態（基態）躍遷到較高能態（激發態）
，這個作用稱為物質對光的吸收。被激發的粒子約在10^-8s後回到基態
，並以熱或熒光等形式釋放出能量。分子、原子或離子具有不連續的量子化能級，僅當照射光光子的能量h_υ，與被照射物質粒子的基態和激發態能量之差相當時，才能發生吸收。不同物質微粒由於結構不同而具有不同的量子化能級，其基態和激發態能量差也不相同。所以物質對光的吸收具有選擇性。

（3） 吸收曲線
吸(xi)收(shou)曲(qu)線(xian)，也(ye)稱(cheng)為(wei)吸(xi)收(shou)光(guang)譜(pu)，描(miao)述(shu)了(le)物(wu)質(zhi)對(dui)不(bu)同(tong)波(bo)長(chang)的(de)光(guang)的(de)吸(xi)收(shou)能(neng)力(li)。將(jiang)不(bu)同(tong)波(bo)長(chang)的(de)光(guang)透(tou)過(guo)某(mou)一(yi)固(gu)定(ding)濃(nong)度(du)和(he)厚(hou)度(du)的(de)有(you)色(se)溶(rong)液(ye)
，測(ce)量(liang)每(mei)一(yi)波(bo)長(chang)下(xia)有(you)色(se)溶(rong)液(ye)對(dui)光(guang)的(de)吸(xi)收(shou)程(cheng)度(du)（即吸光度），然後以波長為橫坐標，以吸光度為縱坐標作圖，繪製的曲線即為吸收曲線。
不同濃度的同一物質，在吸收峰附近的吸光度隨著濃度增加而增大，但最大吸收波長不變。若在最大吸收波長處測定吸光度，則靈敏度最高。因此，吸收曲線是分光光度法中選擇測定波長的重要依據。
2、光吸收基本定律
即朗伯-比爾定律：
當一束平行單色光通過液層厚度為b的de有you色se溶rong液ye時shi，溶rong質zhi吸xi收shou了le光guang能neng

，光guang的de強qiang度du就jiu要yao減jian弱ruo。溶rong液ye的de濃nong度du越yue大da，通tong過guo的de液ye層ceng厚hou度du越yue大da
，入ru射she光guang越yue強qiang
，則ze光guang被bei吸xi收shou的de越yue多duo，光guang強qiang度du的de減jian弱ruo也ye越yue顯xian著zhu。該gai定ding律lv是shi紫zi外wai可ke見jian分fen光guang光guang度du法fa等deng各ge類lei吸xi光guang光guang度du法fa定ding量liang分fen析xi的de依yi據ju
，是shi由you實shi驗yan觀guan察cha得de到dao的de，不bu僅jin適shi用yong於yu溶rong液ye
，也ye適shi用yong於yu其qi他ta均jun勻yun非fei散san射she的de吸xi光guang物wu質zhi。
A=lg(I/I₀)=εbc
A-吸光度
；
I₀-入射光強度，cd；
I-透射光強度
，cd；
ε-吸光係數
，L/(mol˙cm)；
b-液層厚度（光程長度）
，cm；
c-有色溶液的濃度，mol/L。
其物理意義為：當一束平行單色光通過單一均勻
、非散射的吸光物質溶液時，溶液的吸光度與溶液濃度和液層厚度的乘積成正比。
式中ε是吸光物質在特定波長和溶劑的情況下的一個特征常數，數值上等於濃度為1mol/L的吸光物質在1cm光程中的吸光度。ε是吸光物質吸光能力的量度，ε值越大，方法的靈敏度越高。由實驗結果計算ε時(shi)，常(chang)以(yi)被(bei)測(ce)物(wu)質(zhi)的(de)總(zong)濃(nong)度(du)代(dai)替(ti)吸(xi)光(guang)物(wu)質(zhi)的(de)濃(nong)度(du)，實(shi)際(ji)上(shang)時(shi)表(biao)觀(guan)摩(mo)爾(er)吸(xi)光(guang)係(xi)數(shu)。在(zai)多(duo)組(zu)分(fen)體(ti)係(xi)中(zhong)，如(ru)果(guo)各(ge)種(zhong)吸(xi)光(guang)物(wu)質(zhi)之(zhi)間(jian)沒(mei)有(you)相(xiang)互(hu)作(zuo)用(yong)
，體(ti)係(xi)的(de)總(zong)吸(xi)光(guang)度(du)等(deng)於(yu)各(ge)組(zu)分(fen)吸(xi)光(guang)度(du)之(zhi)和(he)，即(ji)吸(xi)光(guang)度(du)具(ju)有(you)加(jia)和(he)性(xing)。
透光度T是透射光強度I與入射光強度I₀之比
，即：
T=I/I₀
因此：A=lg(1/T)

2主要部件

盡管光度計種類型號繁多
，但它們都是由相同的基本部件組成的，包括光源、單色器
、吸收池和檢測係統。
1
、光源
在測量吸光度時，要求光源發出所需波長範圍內的連續光譜，要具有足夠的光強度，並在一定時間內能保持穩定。
在可見光區測量時，通常使用鎢絲燈作為光源。鎢絲加熱到白熾狀態時會發出波長在320~2500nm之間的連續光譜。鎢絲燈工作溫度一般為2600~2870K

，熔點為3680K。wusidengdewendujuedingyudianyuandianya
，dianyuandianyadeweixiaobodonghuiyinqiwudengguangqiangdudehendabianhua，yincibixushiyongwenyadianyuan。zaiziwaiquceliangshi，changcaiyong氫燈或氘燈產生波長在180~375nm之zhi間jian的de連lian續xu光guang譜pu作zuo為wei光guang源yuan。其qi理li想xiang光guang源yuan應ying具ju有you覆fu蓋gai整zheng個ge紫zi外wai可ke見jian光guang區qu的de連lian續xu輻fu射she
，強qiang度du應ying比bi較jiao高gao
，且qie隨sui波bo長chang變bian化hua能neng量liang變bian化hua不bu大da，但dan在zai實shi際ji上shang難nan以yi實shi現xian。氘dao燈deng輻fu射she強qiang度du比bi氫qing燈deng高gao2~3倍，壽命也比較長。氙燈的強度一般高於氫燈，但欠穩定
，波長範圍180~1000nm，常用作熒光分光光度計的激發光源。
2
、單色器
單色器是將光源發射的複合光分解為單色光的裝置。
一般由5部分組成：入光狹縫、準光氣（一般由透鏡或凹麵反光鏡使入射光成為平行光束）、色散器、投影器（一般由一個透鏡或凹麵鏡將分光後的單色光投影至出光狹縫）

、出光狹縫。
色散器是單色器的核心部分，常用的色散元件是棱鏡或光柵。
棱鏡由玻璃或石英製成，玻璃棱鏡色散能力強，但吸收紫外光
，隻能用於350-820nm波長的分析測定
，在紫外區必須用石英棱鏡。
光柵的特點是：色散均勻，呈線性，光度測量便於自動化，工作波段廣。
3、吸收池
也稱為比色皿，是盛放樣品溶液的容器，具有兩個互相平行

、透光且具有精確厚度的平麵。
玻璃吸收池光程長度一般為1cm
，也有0.1-10cm的。
由於吸收池厚度存在一定誤差，其材質對光不是完全透明
，在做定量分析時，對吸收池應做配套性試驗
，試驗後標記出放置方向。
紫外光區數值不跳為石英。
4、檢測係統
檢測係統包括檢測器和記錄顯示裝置。
檢測器是一種光電轉換設備
，將光強度轉變為電信號顯示出來。
常用的檢測器有光電池、光電倍增管和光二極管陣列檢測器等。
光電池的光電流較大，不用放大，用於初級的分光光度計上，疲勞效應嚴重。
光電倍增管利用二次電子發射來放大光電流，放大倍數可高達10⁸倍，應用最為廣泛。
光二極管陣列檢測器由於全部波長同時被檢測
，掃描速度快
，可在0.1s內完成對190-800nm波長範圍的掃描。
記錄顯示裝置包括放大器和結果顯示裝置。70年代采用數字讀出裝置。現代在主機中裝備有微處理機或外接微型計算機，控製儀器操作和處理測量數據，裝有屏幕顯示、打印機和繪圖儀等。

3測量條件的選擇

1、顯色反應及顯色條件的選擇
進行比色分析或光度分析時
，首先要把待測組分轉變成有色化合物，然後進行比色或光度測定。
將待測組分轉變成有色化合物的反應叫顯色反應，與待測組分形成有色化合物的試劑稱為顯色劑。

（1）顯色反應的選擇
顯色反應分兩類，即絡合反應和氧化還原反應
，絡合反應是最主要的顯色反應。
選用的原則是：
選擇靈敏的顯色反應。摩爾吸光係數ε的大小是顯色反應靈敏度高低的重要標誌
，因此應當選擇生成的有色物質的ε較大的顯色反應。一般來說，當ε為10⁴-10⁵時，可認為該反應靈敏度較高。
 盡可能選擇選擇性好的顯色劑。即顯色劑僅與一個組分或少數幾個組分發生顯色反應。
顯色劑在測定波長處無明顯吸收。通常把兩種有色物質最大吸收波長之差稱為對比度
，一般要求顯色劑與有色化合物的對比度在60nm以上。
反應生成的有色化合物組成恒定
，化學性質穩定。

（2）顯色條件的選擇
吸xi光guang光guang度du法fa測ce定ding的de是shi顯xian色se反fan應ying達da到dao平ping衡heng後hou溶rong液ye的de吸xi光guang度du
，因yin此ci要yao得de到dao準zhun確que的de結jie果guo，必bi須xu從cong研yan究jiu平ping衡heng著zhe手shou，了le解jie影ying響xiang顯xian色se反fan應ying的de因yin素su
，控kong製zhi適shi當dang的de條tiao件jian，使shi顯xian色se反fan應ying完wan全quan和he穩wen定ding。根gen據ju溶rong液ye平ping衡heng原yuan理li，有you色se絡luo合he物wu的de穩wen定ding常chang數shu越yue大da
，顯xian色se劑ji過guo量liang越yue多duo
，越yue有you利li於yu待dai測ce組zu分fen形xing成cheng有you色se絡luo合he物wu。但dan是shi過guo量liang顯xian色se劑ji的de加jia入ru有you時shi會hui引yin起qi副fu反fan應ying，對dui測ce定ding反fan而er不bu利li。

suanduduixiansefanyingdeyingxiangshiduofangmiande。yizhongjinshuliziyumouzhongxiansejifanyingdeshiyisuandufanweishitongguoshiyanlaiquedingde。quedingdefangfashigudingdaicezufenjixiansejidenongdu
，gaibianrongyepH值
，測定其吸光度
，作出吸光度-pH值關係曲線
，選擇曲線平坦部分對應的pH值作為測定條件。

顯色反應一般在室溫下進行，有的反應需要加熱
，以加速顯色反應，使之進行完全。
大(da)多(duo)數(shu)顯(xian)色(se)反(fan)應(ying)需(xu)要(yao)經(jing)過(guo)一(yi)定(ding)的(de)時(shi)間(jian)才(cai)能(neng)完(wan)成(cheng)，其(qi)長(chang)短(duan)與(yu)溫(wen)度(du)的(de)高(gao)低(di)有(you)關(guan)，也(ye)會(hui)受(shou)到(dao)空(kong)氣(qi)的(de)氧(yang)化(hua)或(huo)發(fa)生(sheng)光(guang)化(hua)學(xue)反(fan)應(ying)使(shi)眼(yan)色(se)顏(yan)色(se)減(jian)弱(ruo)。因(yin)此(ci)必(bi)須(xu)通(tong)過(guo)實(shi)驗(yan)作(zuo)出(chu)在(zai)一(yi)定(ding)溫(wen)度(du)下(xia)的(de)吸(xi)光(guang)度(du)-時間關係曲線
，得到適宜的顯色時間。

4幹擾的消除

1、幹擾的類型
光度分析中，共存離子如本身有顏色，或與顯色劑作用生成有色化合物，都將幹擾測定。
a.幹擾離子本身有顏色
b.幹gan擾rao離li子zi本ben身shen無wu顏yan色se，但dan能neng與yu顯xian色se劑ji反fan應ying生sheng成cheng穩wen定ding的de配pei合he物wu。若ruo生sheng成cheng的de配pei合he物wu有you色se則ze直zhi接jie幹gan擾rao測ce定ding，若ruo生sheng成cheng的de配pei合he物wu無wu色se，也ye降jiang低di了le顯xian色se劑ji的de濃nong度du
，影ying響xiang被bei測ce離li子zi與yu顯xian色se劑ji的de反fan應ying

，而er產chan生sheng誤wu差cha。
c.幹擾離子與被測離子反應生成配合物或沉澱，影響被測離子的測定。

2、消除幹擾的方法
a.控製溶液酸度。
b.加入掩蔽劑與幹擾離子形成更穩定的化合物，使幹擾離子不再產生幹擾。
c.裏用參比溶液消除某些有色幹擾離子的影響。
d.選擇適當的工作波長以消除幹擾。
e.采用適當的分離方法。

5吸光度測量條件的選擇

1、入射光波長的選擇
應根據吸收光譜曲線，選擇溶液具有最大吸收時的波長作為入射光的波長。如顯色劑與鈷絡合物在420nm波長處均有最大吸收峰。如用此波長測定鈷
，則未反應的顯色劑會造成幹擾而降低測定的準確度。因此必須選擇在500nm波長處測定，在此波長下顯色劑不發生吸收。而鈷絡合物則有一吸收平台。

2、參比溶液的選擇
（1）如果僅待測物與顯色劑的反應產物有吸收，可用純溶劑作參比溶液。
（2）如果顯色劑或其他試劑略有吸收，應用空白溶液（不加試樣的溶液）作參比溶液。
（3）rushiyangzhongqitazufenyouxishou，danbuyuxiansejifanying，zedangxiansejiwuxishoushi
，keyongshiyangrongyezuocanbirongye
，dangxiansejilveyouxishoushi，kezaishiyezhongjiarushidangyanbijijiangdaicezufenyanbihouzaijiaxianseji
，yicirongyezuocanbirongye。

3、吸光度讀數範圍的選擇
實踐證明，吸光度在0.2-0.5內時，測量的相對誤差最小。
可用兩種方法來調整被測溶液的吸光度：
（1）控製被測溶液的濃度。如改變取樣量，改變溶液的濃縮倍數或稀釋倍數。
（2）選擇不同的比色皿。吸光度小的溶液要用光程長的比色皿
，吸光度大的溶液要用光程短的比色皿。