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【高效液相色譜儀係統液相色譜儀主要由貯液瓶、泵、進樣器、柱子、柱溫箱、檢測器、數據處理係統組成。對於整個係統而言，柱子、泵和檢測器是核心部件同時也是易出問題的主要部位】
柱壓問題
柱壓問題是使用高效液相色譜過程中需要密切注意的地方，柱壓的穩定與色譜圖峰形的好壞、柱效、分離效果及保留時間等密切相關。所謂柱壓穩定並不是指壓力值穩定於一個恒定值而是指壓力波動範圍在345kPa 以內或在50PSI之間（在使用梯度洗脫時，柱壓平穩緩慢的變化是允許的）。壓力過高、過低都屬於柱壓問題。
01壓力過高
這是高效液相在使用中最常見的問題，指的是壓力突然升高，一般有以下幾個原因：
(1)一般都是由於流路中有堵塞的原因。此時，我們應該分段進行檢查。
a.首先斷開真空泵的入口處，此時PEEK管裏充滿液體，使PEEK管低於溶劑瓶，看液體是否自由滴下，如果液體不滴或緩慢滴下，則是溶劑過濾頭堵塞。處理方法：用30%的硝酸浸泡半個小時，在用超純水衝洗幹淨。如果液體自由滴下，溶劑過濾頭正常，再檢查。
b.打開Purge閥，使流動相不經過柱子，如果壓力沒有明顯下降，則是過濾白頭堵塞。處理方法：將過濾白頭取出，用10%的異丙醇超聲半個小時。如果壓力降至100PSI以下，過濾白頭正常，再檢查。
c.把色譜柱出口端取下，如果壓力不下降，則是柱子堵塞。處理方法：如果是緩衝鹽堵塞，則用95%的de水shui衝chong至zhi壓ya力li正zheng常chang。如ru果guo是shi一yi些xie強qiang保bao留liu的de物wu質zhi導dao致zhi堵du塞sai，則ze要yao用yong比bi現xian在zai流liu動dong相xiang更geng強qiang的de流liu動dong相xiang衝chong至zhi壓ya力li正zheng常chang。假jia如ru按an上shang麵mian的de方fang法fa長chang時shi間jian衝chong洗xi壓ya力li都dou不bu下xia降jiang，則ze可ke考kao慮lv將jiang柱zhu子zi的de進jin出chu口kou反fan過guo來lai接jie在zai儀yi器qi上shang，用yong流liu動dong相xiang衝chong洗xi柱zhu子zi。這zhe時shi，如ru果guo柱zhu壓ya仍reng不bu下xia降jiang，隻zhi有you換huan柱zhu子zi入ru口kou篩shai板ban，但dan一yi旦dan操cao作zuo不bu甚shen，很hen容rong易yi造zao成cheng柱zhu效xiao下xia降jiang，所suo以yi盡jin量liang少shao用yong。問wen題ti無wu法fa解jie決jue可ke考kao慮lv更geng換huan色se譜pu柱zhu。
（2）流速設定不正確：可重新設定正確流量。
（3）流動相配比不正確：不同配比的流動相其黏度係數不相同，較高黏度的流動相相應的係統壓力也大，如果可能可更換黏度較小的溶劑或重新設定配比。
（4）係統壓力零點漂移：調節壓力傳感器的零點。
02壓力過低
（1）一般是由於係統泄漏，處理方法：尋找各個接口處，特別是色譜柱兩端的接口，把泄漏的地方旋緊即可。拆下柱子加適當力擰緊或襯四氟薄膜。
（2）泵裏進了空氣，但此時表現的往往是壓力不穩，忽高忽低，更嚴重一點會導致泵無法吸上液體。處理方法：打開Purge閥，用3~5ml/min的流速衝洗，如果不行，則要用專用針筒在排空閥處借住外力將氣泡吸出。
（3）無流動相流出：檢查儲液瓶中有無流動相，沉子是否浸在流動相中，泵是否運行。
（4）參比閥未關閉：將流速降低後關閉參比閥。一般降至0.1～0.2mL/min後關閉參比閥。
基線問題
03基線漂移
基線漂移是色譜工作者普遍遇到的問題,在實際工作中,我們經常能遇到基線漂移的情況,特別是在梯度洗脫的時候,基線漂移是常有的事。一般說來，機器剛起動時，基線容易漂移，大概要30min的平衡時間，如果你用了緩衝溶液或緩衝鹽，還有就是在低波長下（220nm）平衡時間相對會比較長，但如果你在實驗過程中發現基線漂移，則你要考慮下麵的原因：
（1）柱溫波動 控kong製zhi好hao柱zhu子zi和he流liu動dong相xiang的de溫wen度du，檢jian查zha是shi否fou有you打da開kai的de窗chuang戶hu或huo空kong調tiao對dui著zhe柱zhu溫wen箱xiang。即ji使shi是shi很hen小xiao的de溫wen度du變bian化hua都dou會hui引yin起qi基ji線xian的de波bo動dong。通tong常chang影ying響xiang示shi差cha檢jian測ce器qi、電導檢測器、較低靈敏度的紫外檢測器或其它光電類檢測器。控製好柱子和流動相的溫度，在檢測器之前使用熱交換器。
（2）流通池被汙染或有氣體 用甲醇或其他強極性溶劑衝洗流通池（最好斷開柱子）。如有需要，可以用1N的硝酸（不要用鹽酸）。
（3）紫外燈能量不足 更換新的紫外燈
（4）流動相汙染、變質或由低品質溶劑配成。檢查流動相的組成，使用高品質的化學試劑及HPLC級的溶劑。
04基線噪音
對於紫外檢測器, 氘燈光源打開後要預熱30 min以上, 基線才能穩定。噪聲是指與被測物無關的檢測器輸出信號的隨機擾動變化, 分短期噪聲和長期噪聲兩種。
氘燈用的過久, 接近壽命期時( 氘燈的壽命約1 000 h) , 會使基線噪音明顯增加, 應及時更換氘燈。除光源外, 流路中的氣泡也會產生噪音。對於判斷基線噪聲增大是由於光源燈的老化還是來自流路中的氣泡的問題, 可將泵關上, 繼續走基線, 如果噪聲立即停止, 基線呈一條直線, 說明基線噪聲來自流動相中的氣泡, 應設法排氣; 若停泵後仍有噪音出現, 應考慮是燈的問題。
基線噪音(規則的)
產生基線噪音的原因有：在流動相、檢測器或泵中有空氣；漏液；流動相混合不完全；溫度影響(柱溫過高，檢測器未加熱)；在同一條線上有其他電子設備；泵振動。
為了避免基線噪音，在正式進樣之前,需要對流動相脫氣；衝洗係統以除去檢測器或泵中的空氣；檢查管路接頭是否鬆動；泵是否漏液；是否有鹽析出和不正常的噪音，如有必要，更換泵密封；用手搖動使溶劑混合均勻或使用低粘度的溶劑減少差異或加上熱交換器；有其他電子設備時斷開LC、檢測器和記錄儀，檢查幹擾是否來自於外部，加以更正；泵振動時在係統中加入脈衝阻尼器。
基線噪音(不規則的)
(1) 漏液：檢查接頭是否鬆動，泵是否漏液,是否有鹽析出和不正常的噪音。如有必要，更換密封，檢查流通池是否漏液。
(2) 流動相汙染、變質或由低質溶劑配成：檢查流動相的組成。
(3) 流動相各溶劑不相溶：選擇互溶的流動相。
(4) 檢測器/記錄儀電子元件的問題：斷開檢測器和記錄儀的電源，檢查並更正。
(5) 係統內有氣泡：用強極性溶液清洗係統；檢測器內有氣泡，清洗檢測器，在檢測器後麵安裝背景壓力調節器。
(6) 流通池汙染(即使是極少的汙染物也會產生噪音) :用硝酸清洗流通池;
(7) 檢測器燈能量時不足更換燈;
(8) 色譜柱填料流失或阻塞：更換色譜柱。
(9) 流動相混合不均勻或混合器工作不正常：維修或更換混合器，在流動相不走梯度時，不建議使用泵的混合裝置。
保留時間
baoliushijiandepiaoyiwangwangyouzhulaohuayinqi，erzhulaohuabukenengyinqibaoliushijiandewuguilvbodong。shishishang，baoliushijianpiaoyideduobanyuanyinshiyouyubutongjilidesepuzhulaohua，rugudingxiangliushi(例如通過水解)，色譜柱汙染(由樣品或流動相所致)等。保留時間漂移的幾種最常見的原因和解決方法如下：
05色譜柱平衡
如果觀察到保留時間漂移，首先應考慮色譜柱是否已經平衡。在每一次運行之前給予足夠的時間平衡色譜柱。通常平衡需要10～20個柱體積的流動相，但如果在流動相中加入少量添加劑(如離子對試劑)則(ze)需(xu)要(yao)相(xiang)當(dang)長(chang)的(de)時(shi)間(jian)來(lai)平(ping)衡(heng)色(se)譜(pu)柱(zhu)。流(liu)動(dong)相(xiang)汙(wu)染(ran)也(ye)可(ke)能(neng)是(shi)原(yuan)因(yin)之(zhi)一(yi)。溶(rong)於(yu)流(liu)動(dong)相(xiang)中(zhong)的(de)少(shao)量(liang)汙(wu)染(ran)物(wu)可(ke)能(neng)慢(man)慢(man)富(fu)集(ji)到(dao)色(se)譜(pu)柱(zhu)上(shang)，從(cong)而(er)造(zao)成(cheng)保(bao)留(liu)時(shi)間(jian)的(de)漂(piao)移(yi)。應(ying)注(zhu)意(yi)：水是很容易汙染的流動相成分。
06固定相穩定性
固定相的穩定性都是有限的，即使在推薦的pH範圍內使用，固定相也會慢慢水解。例如，矽膠基質在pH4時水解穩定性最好，水解速度與流動相類型和配體有關。雙官能團配體和三官能團配體比單官能團配體的鍵合相要穩定；長鏈鍵合相比短鏈鍵合相穩定；wanjijianhexiangbiqingjijianhexiangwendingdeduo。jingchangqingxisepuzhuyihuijiasusepuzhugudingxiangdeshuijie。qitaguijiaojizhijianhexiangzaishuirongyehuanjingzhongyekeyifashengshuijie,如氨基鍵合相等。
07色譜柱汙染
保留時間漂移的另一個常見原因是色譜柱汙染。HPLC色譜柱是非常有效的吸附性過濾器，它可以過濾並吸附流動相攜帶的任何物質。
汙染源可以是：流動相本身，流動相容器,連接管、泵、進(jin)樣(yang)器(qi)和(he)儀(yi)器(qi)密(mi)封(feng)墊(dian)，以(yi)及(ji)樣(yang)品(pin)等(deng)。通(tong)常(chang)通(tong)過(guo)實(shi)驗(yan)可(ke)判(pan)斷(duan)汙(wu)染(ran)的(de)來(lai)源(yuan)。樣(yang)品(pin)中(zhong)如(ru)果(guo)存(cun)在(zai)色(se)譜(pu)柱(zhu)上(shang)保(bao)留(liu)很(hen)強(qiang)的(de)組(zu)分(fen)，就(jiu)可(ke)能(neng)是(shi)使(shi)保(bao)留(liu)時(shi)間(jian)漂(piao)移(yi)的(de)潛(qian)在(zai)根(gen)源(yuan)。這(zhe)些(xie)根(gen)源(yuan)通(tong)常(chang)是(shi)樣(yang)品(pin)基(ji)質(zhi)，如(ru)：配藥中的賦形劑，生化樣品(如血清)中的蛋白及類脂類化合物，食品樣品中的澱粉，環境水樣中的腐殖酸等。
通常樣品中的強保留組分具有較高的分子量，在此情況下,保留時間漂移的同時或其後會有反壓的增加，可以通過使用固相提取( SPE)等樣品前處理方法來去除樣品基質的影響，避免色譜柱汙染最簡單的方法是防患於未然。
相xiang比bi之zhi下xia，找zhao到dao問wen題ti的de所suo在zai並bing設she計ji有you效xiao的de清qing洗xi步bu驟zhou以yi去qu除chu汙wu染ran物wu要yao困kun難nan的de多duo。通tong常chang使shi用yong在zai給gei定ding色se譜pu條tiao件jian下xia的de強qiang溶rong劑ji，但dan並bing非fei所suo有you汙wu染ran物wu都dou可ke以yi在zai流liu動dong相xiang中zhong溶rong解jie。如ruTHF可去除反相色譜柱中的許多汙染物，但蛋白在THF中就不能溶解， DMSO常常用於去除反相色譜柱中的蛋白。使用保護柱是個非常有效的方法。反衝色譜柱僅是不得已時采用的辦法。
08流動相組成
流動相組成的緩慢變化也是保留時間漂移的常見原因。如流動相中易揮發組分的揮發及循環使用流動相等，應防止流動相由於蒸發、反應等等原因造成的變化。
保留時間重現是液相性能好壞的一個重要標誌，同一種東西，兩次的保留時間相差不要超過15s，超過了半分鍾可看做保留時間漂移，就無法進行定性。
峰型異常問題
峰(feng)型(xing)問(wen)題(ti)是(shi)液(ye)相(xiang)的(de)主(zhu)要(yao)問(wen)題(ti)，在(zai)做(zuo)液(ye)相(xiang)過(guo)程(cheng)中(zhong)，我(wo)們(men)就(jiu)是(shi)要(yao)變(bian)換(huan)不(bu)同(tong)的(de)條(tiao)件(jian)來(lai)改(gai)善(shan)不(bu)好(hao)的(de)峰(feng)型(xing)，對(dui)於(yu)各(ge)種(zhong)各(ge)樣(yang)的(de)異(yi)常(chang)峰(feng)，要(yao)區(qu)別(bie)對(dui)待(dai)，從(cong)主(zhu)要(yao)問(wen)題(ti)出(chu)發(fa)，一(yi)個(ge)一(yi)個(ge)加(jia)以(yi)解(jie)決(jue)。
09色譜圖中未出峰
係統未進樣或樣品分解；泵未輸液或流動相使用不正確；檢測器設置不正確；針對以上情況成因作相應調整即可。
10一個或幾個峰是負峰
流動相吸收本底高；進樣過程中進入空氣；樣品組分的吸收低於流動相。
11所有峰均為負峰
信號電纜接反或檢測器輸出極性設置顛倒；光學裝置尚未達到平衡。
12所有峰均為寬峰
係統未達到平衡；溶解樣品的溶劑極性比流動相差很多；色譜柱尺寸及類型選擇不正確；色譜柱或保護柱被汙染或柱效降低；溫度變化造成的影響。
13所出峰比預想的小
樣品黏度過大；進樣品故障或進樣體積誤差；檢測器設置不正確．定量環體積不正確；檢測池汙染；檢測器燈出現問題。
14出現雙峰或肩峰
進樣量過大；樣品濃度過高；保護柱或色譜柱柱頭堵塞；保護拄或色譜柱汙染或失效；柱塌陷或形成短通道。
15前伸峰
進樣量或樣品濃度高，溶解樣品的溶劑較流動相極性強；保護柱或色譜柱汙染或失效。
①柱溫低：升高柱溫；
②樣品溶劑選擇不恰當：使用流動相作為樣品溶劑；
③樣品過載：降低樣品含量；
④色譜柱損壞：更換柱子。
16拖尾峰
柱超載，降低樣品量；增加柱直徑采用較高容量的固定相；峰幹擾，對樣品進行清潔過濾；調整流動相；矽羥基作用，加入三乙胺，用堿致鈍化柱增加緩衝液或鹽的濃度降低流動相pH值；
死體積或柱外體積過大，將連接點降至最低；盡可能使用內徑較細的連接管；
柱效下降，更換柱子；采用保護柱，對柱子進行再生。
17出現平頭峰
檢測器設置不正確；進樣體積太大或樣品濃度太高。
18出現鬼峰
進樣閥殘餘峰，可能為上次樣品的殘餘。在每次進完樣後用充足的時間來平衡和清洗係統；樣品中存在未知物，改進樣品的預處理；流動相汙染，更換新流動相，盡可能現配現用，隔夜的流動相再次使用時要過濾；盡可能使用HPLC級試劑；流路中有小的氣泡，打開Purge閥，加大流速排除。
19峰分叉
①保護柱或分析柱汙染：取下保護柱再進行分析,如果必要更換保護柱。如果分析柱阻塞,拆下來清洗。如果問題仍然存在,可能是柱子被強保留物質汙染,運用適當的再生措施。如果問題仍然存在,入口可能被阻塞,更換篩板或更換色譜柱。
②樣品溶劑不溶於流動相改變樣品溶劑,如果可能采取流動相作為樣品溶劑。
20峰變形
樣品過載，減少樣品進樣量。
21早出的峰變形
樣品溶劑選擇不恰當
①減少進樣體積
②運用低極性樣品溶劑
22早出的峰拖尾程度大
柱外效應
①調整係統連接(使用更短、內徑更小的管路)
②使用小體積的流通池
23額外的峰
（1）樣品中有其他組分：正常現象；
（2）前一次進樣的洗脫峰：①增加運行時間或梯度斜率②提高流速；
（3）空位或鬼峰：①檢查流動相是否純淨 ②使用流動相作為樣品溶劑 ③減少進樣體積。
小結
yishangneirongzhishiduiyexiangsepuzhongchuxiandechangjiandewentijinxinglefenxi，dangranzaiwomenshijiyingyongdangzhonghaihuiyudaogengduodeqitawenti，zaiguzhangpaichushiyaozunshouyixiayuanze：一次隻改變一個因素，確定假定因素與問題之間的聯係；如果通過更換組件來排查故障時要注意將拆下的完好組件裝回原位，避免浪費；養yang成cheng良liang好hao的de記ji錄lu習xi慣guan，這zhe是shi成cheng功gong進jin行xing故gu障zhang排pai除chu的de關guan鍵jian。總zong之zhi，在zai使shi用yong高gao效xiao液ye相xiang色se譜pu時shi一yi定ding要yao注zhu意yi樣yang品pin的de前qian處chu理li與yu儀yi器qi的de正zheng確que操cao作zuo和he保bao養yang。
