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原理
分光光度法是指應用分光光度計的分析方法，因其具有靈敏、準確、kuaisujixuanzexinghaodengtedianbeiguangfanyingyongyushiyanshideyuansufenxi，fenguangguangdujideshiyongsuiranjiandan，danshiqiyuanlijiyixiejichuzhishixiangbiyouxuduoxiaohuobanyeshibulejiede，fenxianggeidajia，xiwangnengduiniyousuobangzhu。
當光束照射到物質上時，光與物質發生相互作用，產生反射、散射、吸收或透射。若被照射的是均勻溶液，光的散射可以忽略。
當(dang)一(yi)束(shu)白(bai)光(guang)通(tong)過(guo)某(mou)一(yi)有(you)色(se)溶(rong)液(ye)時(shi)，一(yi)些(xie)波(bo)長(chang)的(de)光(guang)被(bei)溶(rong)液(ye)吸(xi)收(shou)，另(ling)一(yi)些(xie)波(bo)長(chang)的(de)光(guang)則(ze)透(tou)過(guo)溶(rong)液(ye)。透(tou)射(she)光(guang)或(huo)反(fan)射(she)光(guang)刺(ci)激(ji)人(ren)眼(yan)使(shi)人(ren)感(gan)到(dao)顏(yan)色(se)的(de)存(cun)在(zai)。人(ren)把(ba)自(zi)身(shen)能(neng)感(gan)覺(jiao)到(dao)的(de)光(guang)定(ding)義(yi)為(wei)可(ke)見(jian)光(guang)。在(zai)可(ke)見(jian)光(guang)區(qu)，不(bu)同(tong)波(bo)長(chang)的(de)光(guang)呈(cheng)現(xian)不(bu)同(tong)的(de)顏(yan)色(se)，因(yin)此(ci)溶(rong)液(ye)的(de)顏(yan)色(se)由(you)透(tou)射(she)光(guang)的(de)波(bo)長(chang)所(suo)決(jue)定(ding)。透(tou)射(she)光(guang)與(yu)吸(xi)收(shou)光(guang)可(ke)組(zu)成(cheng)白(bai)光(guang)，故(gu)稱(cheng)這(zhe)兩(liang)種(zhong)光(guang)互(hu)為(wei)補(bu)色(se)光(guang)，兩(liang)種(zhong)顏(yan)色(se)互(hu)為(wei)補(bu)色(se)。
當一束光照射到某物質或其溶液時，組成該物質的分子、原子或離子與光子發生“碰撞”，光子的能量就轉移到分子、原子或離子上，是這些粒子由最低能態（基態）躍遷到較高能態（激發態），這個作用稱為物質對光的吸收。
被激發的粒子約在10-8s後回到基態，並以熱或熒光等形式釋放出能量。分子、原子或離子具有不連續的量子化能級，僅當照射光光子的能量hυ，與(yu)被(bei)照(zhao)射(she)物(wu)質(zhi)粒(li)子(zi)的(de)基(ji)態(tai)和(he)激(ji)發(fa)態(tai)能(neng)量(liang)之(zhi)差(cha)相(xiang)當(dang)時(shi)，才(cai)能(neng)發(fa)生(sheng)吸(xi)收(shou)。不(bu)同(tong)物(wu)質(zhi)微(wei)粒(li)由(you)於(yu)結(jie)構(gou)不(bu)同(tong)而(er)具(ju)有(you)不(bu)同(tong)的(de)量(liang)子(zi)化(hua)能(neng)級(ji)，其(qi)基(ji)態(tai)和(he)激(ji)發(fa)態(tai)能(neng)量(liang)差(cha)也(ye)不(bu)相(xiang)同(tong)。所(suo)以(yi)物(wu)質(zhi)對(dui)光(guang)的(de)吸(xi)收(shou)具(ju)有(you)選(xuan)擇(ze)性(xing)。
xishouquxian，yechengweixishouguangpu，miaoshulewuzhiduibutongbochangdeguangdexishounengli。jiangbutongbochangdeguangtouguomouyigudingnongduhehoududeyouserongye，celiangmeiyibochangxiayouserongyeduiguangdexishouchengdu（即吸光度），然後以波長為橫坐標，以吸光度為縱坐標作圖，繪製的曲線即為吸收曲線。
不bu同tong濃nong度du的de同tong一yi物wu質zhi，在zai吸xi收shou峰feng附fu近jin的de吸xi光guang度du隨sui著zhe濃nong度du增zeng加jia而er增zeng大da，但dan最zui大da吸xi收shou波bo長chang不bu變bian。若ruo在zai最zui大da吸xi收shou波bo長chang處chu測ce定ding吸xi光guang度du，則ze靈ling敏min度du最zui高gao。因yin此ci，吸xi收shou曲qu線xian是shi分fen光guang光guang度du法fa中zhong選xuan擇ze測ce定ding波bo長chang的de重zhong要yao依yi據ju。
即朗伯-比爾定律：
當一束平行單色光通過液層厚度為b的de有you色se溶rong液ye時shi，溶rong質zhi吸xi收shou了le光guang能neng，光guang的de強qiang度du就jiu要yao減jian弱ruo。溶rong液ye的de濃nong度du越yue大da，通tong過guo的de液ye層ceng厚hou度du越yue大da，入ru射she光guang越yue強qiang，則ze光guang被bei吸xi收shou的de越yue多duo，光guang強qiang度du的de減jian弱ruo也ye越yue顯xian著zhu。該gai定ding律lv是shi紫zi外wai可ke見jian分fen光guang光guang度du法fa等deng各ge類lei吸xi光guang光guang度du法fa定ding量liang分fen析xi的de依yi據ju，是shi由you實shi驗yan觀guan察cha得de到dao的de，不bu僅jin適shi用yong於yu溶rong液ye，也ye適shi用yong於yu其qi他ta均jun勻yun非fei散san射she的de吸xi光guang物wu質zhi。
A=lg(I/I0)=εbc
A-吸光度；
I0-入射光強度，cd；
I-透射光強度，cd；
ε-吸光係數，L/(mol˙cm)；
b-液層厚度（光程長度），cm；
c-有色溶液的濃度，mol/L。
其物理意義為：當一束平行單色光通過單一均勻、非散射的吸光物質溶液時，溶液的吸光度與溶液濃度和液層厚度的乘積成正比。
式中ε是吸光物質在特定波長和溶劑的情況下的一個特征常數，數值上等於濃度為1mol/L的吸光物質在1cm光程中的吸光度。ε是吸光物質吸光能力的量度，ε值越大，方法的靈敏度越高。由實驗結果計算ε時，常以被測物質的總濃度代替吸光物質的濃度，實際上時表觀摩爾吸光係數。
T=I/I0
因此：A=lg(1/T)
主要部件
在測量吸光度時，要求光源發出所需波長範圍內的連續光譜，要具有足夠的光強度，並在一定時間內能保持穩定。
在可見光區測量時，通常使用鎢絲燈作為光源。鎢絲加熱到白熾狀態時會發出波長在320~2500nm之間的連續光譜。鎢絲燈工作溫度一般為2600~2870K，熔點為3680K。鎢絲燈的溫度決定於電源電壓，電源電壓的微小波動會引起鎢燈光強度的很大變化，因此必須使用穩壓電源。
在紫外區測量時，常采用氫燈或氘燈產生波長在180~375nm之(zhi)間(jian)的(de)連(lian)續(xu)光(guang)譜(pu)作(zuo)為(wei)光(guang)源(yuan)。其(qi)理(li)想(xiang)光(guang)源(yuan)應(ying)具(ju)有(you)覆(fu)蓋(gai)整(zheng)個(ge)紫(zi)外(wai)可(ke)見(jian)光(guang)區(qu)的(de)連(lian)續(xu)輻(fu)射(she)，強(qiang)度(du)應(ying)比(bi)較(jiao)高(gao)，且(qie)隨(sui)波(bo)長(chang)變(bian)化(hua)能(neng)量(liang)變(bian)化(hua)不(bu)大(da)，但(dan)在(zai)實(shi)際(ji)上(shang)難(nan)以(yi)實(shi)現(xian)。氘(dao)燈(deng)輻(fu)射(she)強(qiang)度(du)比(bi)氫(qing)燈(deng)高(gao)2~3倍，壽命也比較長。氙燈的強度一般高於氫燈，但欠穩定，波長範圍180~1000nm，常用作熒光分光光度計的激發光源。
單色器是將光源發射的複合光分解為單色光的裝置。
一般由5部分組成：入光狹縫、準光氣（一般由透鏡或凹麵反光鏡使入射光成為平行光束）、色散器、投影器（一般由一個透鏡或凹麵鏡將分光後的單色光投影至出光狹縫）、出光狹縫。
色散器是單色器的核心部分，常用的色散元件是棱鏡或光柵。
棱鏡由玻璃或石英製成，玻璃棱鏡色散能力強，但吸收紫外光，隻能用於350-820nm波長的分析測定，在紫外區必須用石英棱鏡。
光柵的特點是：色散均勻，呈線性，光度測量便於自動化，工作波段廣。
也稱為比色皿，是盛放樣品溶液的容器，具有兩個互相平行、透光且具有精確厚度的平麵。
玻璃吸收池光程長度一般為1cm，也有0.1-10cm的。
由於吸收池厚度存在一定誤差，其材質對光不是完全透明，在做定量分析時，對吸收池應做配套性試驗，試驗後標記出放置方向。
紫外光區數值不跳為石英。
檢測係統包括檢測器和記錄顯示裝置。
檢測器是一種光電轉換設備，將光強度轉變為電信號顯示出來。
常用的檢測器有光電池、光電倍增管和光二極管陣列檢測器等。
光電池的光電流較大，不用放大，用於初級的分光光度計上，疲勞效應嚴重。
光電倍增管利用二次電子發射來放大光電流，放大倍數可高達108倍，應用最為廣泛。
光二極管陣列檢測器由於全部波長同時被檢測，掃描速度快，可在0.1s內完成對190-800nm波長範圍的掃描。
記錄顯示裝置包括放大器和結果顯示裝置。70年代采用數字讀出裝置。現代在主機中裝備有微處理機或外接微型計算機，控製儀器操作和處理測量數據，裝有屏幕顯示、打印機和繪圖儀等。
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測量條件的選擇
進行比色分析或光度分析時，首先要把待測組分轉變成有色化合物，然後進行比色或光度測定。
將待測組分轉變成有色化合物的反應叫顯色反應，與待測組分形成有色化合物的試劑稱為顯色劑。
顯色反應分兩類，即絡合反應和氧化還原反應，絡合反應是最主要的顯色反應。
選用的原則是：
選擇靈敏的顯色反應。摩爾吸光係數ε的大小是顯色反應靈敏度高低的重要標誌，因此應當選擇生成的有色物質的ε較大的顯色反應。一般來說，當ε為104-105時，可認為該反應靈敏度較高。
盡可能選擇選擇性好的顯色劑。即顯色劑僅與一個組分或少數幾個組分發生顯色反應。
吸xi光guang光guang度du法fa測ce定ding的de是shi顯xian色se反fan應ying達da到dao平ping衡heng後hou溶rong液ye的de吸xi光guang度du，因yin此ci要yao得de到dao準zhun確que的de結jie果guo，必bi須xu從cong研yan究jiu平ping衡heng著zhe手shou，了le解jie影ying響xiang顯xian色se反fan應ying的de因yin素su，控kong製zhi適shi當dang的de條tiao件jian，使shi顯xian色se反fan應ying完wan全quan和he穩wen定ding。
根gen據ju溶rong液ye平ping衡heng原yuan理li，有you色se絡luo合he物wu的de穩wen定ding常chang數shu越yue大da，顯xian色se劑ji過guo量liang越yue多duo，越yue有you利li於yu待dai測ce組zu分fen形xing成cheng有you色se絡luo合he物wu。但dan是shi過guo量liang顯xian色se劑ji的de加jia入ru有you時shi會hui引yin起qi副fu反fan應ying，對dui測ce定ding反fan而er不bu利li。
幹擾的消除
光度分析中，共存離子如本身有顏色，或與顯色劑作用生成有色化合物，都將幹擾測定。
a.幹擾離子本身有顏色
b.幹gan擾rao離li子zi本ben身shen無wu顏yan色se，但dan能neng與yu顯xian色se劑ji反fan應ying生sheng成cheng穩wen定ding的de配pei合he物wu。若ruo生sheng成cheng的de配pei合he物wu有you色se則ze直zhi接jie幹gan擾rao測ce定ding，若ruo生sheng成cheng的de配pei合he物wu無wu色se，也ye降jiang低di了le顯xian色se劑ji的de濃nong度du，影ying響xiang被bei測ce離li子zi與yu顯xian色se劑ji的de反fan應ying，而er產chan生sheng誤wu差cha。
c.幹擾離子與被測離子反應生成配合物或沉澱，影響被測離子的測定。
a.控製溶液酸度。
b.加入掩蔽劑與幹擾離子形成更穩定的化合物，使幹擾離子不再產生幹擾。
c.裏用參比溶液消除某些有色幹擾離子的影響。
d.選擇適當的工作波長以消除幹擾。
e.采用適當的分離方法。
吸光度測量條件的選擇
應根據吸收光譜曲線，選擇溶液具有最大吸收時的波長作為入射光的波長。如顯色劑與鈷絡合物在420nm波長處均有最大吸收峰。如用此波長測定鈷，則未反應的顯色劑會造成幹擾而降低測定的準確度。因此必須選擇在500nm波長處測定，在此波長下顯色劑不發生吸收。而鈷絡合物則有一吸收平台。
（1）如果僅待測物與顯色劑的反應產物有吸收，可用純溶劑作參比溶液。
（2）如果顯色劑或其他試劑略有吸收，應用空白溶液（不加試樣的溶液）作參比溶液。
（3）如(ru)試(shi)樣(yang)中(zhong)其(qi)他(ta)組(zu)分(fen)有(you)吸(xi)收(shou)，但(dan)不(bu)與(yu)顯(xian)色(se)劑(ji)反(fan)應(ying)，則(ze)當(dang)顯(xian)色(se)劑(ji)無(wu)吸(xi)收(shou)時(shi)，可(ke)用(yong)試(shi)樣(yang)溶(rong)液(ye)作(zuo)參(can)比(bi)溶(rong)液(ye)，當(dang)顯(xian)色(se)劑(ji)略(lve)有(you)吸(xi)收(shou)時(shi)，可(ke)在(zai)試(shi)液(ye)中(zhong)加(jia)入(ru)適(shi)當(dang)掩(yan)蔽(bi)劑(ji)將(jiang)待(dai)測(ce)組(zu)分(fen)掩(yan)蔽(bi)後(hou)再(zai)加(jia)顯(xian)色(se)劑(ji)，以(yi)此(ci)溶(rong)液(ye)作(zuo)參(can)比(bi)溶(rong)液(ye)。
實踐證明，吸光度在0.2-0.5內時，測量的相對誤差最小。
可用兩種方法來調整被測溶液的吸光度：
（1）控製被測溶液的濃度。如改變取樣量，改變溶液的濃縮倍數或稀釋倍數。
（2）選擇不同的比色皿。吸光度小的溶液要用光程長的比色皿，吸光度大的溶液要用光程短的比色皿。
