一
、 實驗目的

1、 了解測定蛋白質的常用方法

2、 掌握蛋白質含量測定的經典Lowry – Folin法。

二
、 實驗原理

在堿性溶液中，蛋白質中的肽鍵與銅鹽可產生雙縮脲反應，產生絡合物，此絡合物會將磷鉬酸-磷鎢酸試劑還原
，產生深藍色複合物。在一定的條件下，藍色深淺與蛋白質的量成正比。在波長540nm處測定樣品的吸光度，與標準曲線對比，可確定其蛋白質含量。這種方法是檢測可溶性蛋白質含量最靈敏的經典方法之一。

三、 實驗步驟

1、 標準曲線的繪製

(1) 取10ml具塞試管6支，編號，分別準確吸取0.00、0.20、0.40、0.60
、0.80、1.00ml血清蛋白溶液置於相應的試管中，在各試管中分別加入1.00、0.80、0.60、0.40
、0.20和0.00ml的蒸餾水，使總體積達到1.00ml。不同濃度BSA 溶液的配置

編號 0（空白） 1 2 3 4 5

BSA （ml） 0 0.20 0.40 0.60 0.80 1.00

水（ml） 1.00 0.80 0.60 0.40 0.20 0

BSA 質量（µg） 0 40 80 120 160 200

(2) 取試劑A15.00ml，試劑B0.75ml和試劑C0.75ml
，在50ml三角瓶中混勻，在每隻試管中分別準確加入此試劑1.00ml，充分搖勻，靜置15min.

(3) 分別在各試管中準確加入Folin-酚試劑稀釋液3.00ml

，立刻震蕩，充分搖勻。

(4) 靜置30min
，在540nm波長下測定每個試管中溶液的吸光度(A值)。

(5) 以A值為縱坐標，BSA 質量(即0~200µg)為橫坐標，繪製標準曲線
，求出回歸方程和相關係數R2。

2、 樣品的測定

將啤酒樣品適當稀釋(20倍)
，吸取2份
，各1.00ml，重複步驟1中的(2)~(4)。

四、 實驗試劑

1、 試劑A：稱取Na2CO3100.0g溶於1000ml(最終體積)0.5mol/LNaOH中。

2
、 試劑B：稱取CuSO4·5H2O1.0g溶於100ml(最終體積)蒸餾水中。

3、 試劑C：稱取酒石酸鉀鈉2.0g溶於100ml(最終體積)蒸餾水中。

4、 牛血清蛋白 (BSA)標準溶液：準確稱取牛血清蛋白，配製成濃度為200µg/ml的溶液。

5、 2mol/LFolin-酚試劑。

五、 實驗數據與處理

分組 0（空白） 1 2 3 4 5 樣品1 樣品2

吸光度 0.000 0.073 0.157 0.216 0.273 0.341 0.172 0.164

樣品中蛋白質的含量(µg/ml) = XA Ⅹ N Ⅹ 0.001

式中，XA——根據標準曲線計算出來的蛋白質量(對應稀釋樣品中的蛋白質濃度
，µg/ml) N——樣品的稀釋度數(N=20)

計算：標準曲線 y = 0.0017x + 0.0078(R2=0.9957)

當y1=0.172時

，代入得x1=96.59(µg/ml)樣品1中蛋白質含量m1=1.93mg/ml

當y1=0.172時，代入得x1=96.59(µg/ml)樣品1中蛋白質含量m1=1.93mg/ml

當y2=0.164時，代入得x2=91.88(µg/ml)樣品2中蛋白質含量m2=1.84mg/ml

平均含量：(1.93+1.84)/2=1.885 mg/ml

平均偏差：(1.93-1.84)/2 = 0.045

相對平均偏差：0.045/1.885 Ⅹ 100% = 2.39%

六、 實驗注意事項

1、 加入Folin-酚試劑後立即將反應液搖勻，以便Folin-酚試劑在堿性溶液中破壞之前即能被銅-蛋白質複合物還原。

2
、 短時間內反應液的顏色保持穩定
，因此
，靜置30min後應立即測定吸光度，若拖延時間過長，顏色將會變化

，影響測定結果。

七、 思考題

1、 測定食品中蛋白質含量的常用方法有哪些?其原理
、適用性如何?

答：①凱氏定氮法

原理：樣品與濃硫酸共熱
，含氮有機物即分解產生氮(消化)，氮dan又you與yu硫liu酸suan作zuo用yong
，變bian成cheng硫liu酸suan氫qing。經jing強qiang堿jian堿jian化hua使shi之zhi分fen解jie放fang出chu氫qing氣qi，借jie蒸zheng汽qi將jiang氨an蒸zheng至zhi酸suan液ye中zhong，根gen據ju此ci酸suan液ye被bei中zhong和he的de程cheng度du可ke計ji算suan得de樣yang品pin的de氮dan含han量liang，再zai乘cheng以yi6.25，即得樣品中蛋白質含量，以甘氨酸為例
，反應式為：

NH2CH2COOH + 3H2SO4——2CO2+3SO2+4H2O+NH3

2NH3+H2SO4——(NH4)2SO4

(NH4)2SO4+2NaOH——2H2O+NaSO4+2NH3

適用性：用於標準蛋白質含量的準確測定
，幹擾少，費事太長;靈敏度低，適用於0.2~1.0mg氮
，誤差為±2%。

②雙縮脲法

原理：在強堿性溶液中，雙縮脲與CuSO4xingchengziseluohewu，chengweishuangsuoniaofanying。fanjuyoulianggexiananjihuoliangezhijielianjiedetaijian，huonengguoyigezhongjiantanyuanzixiangliandetaijian，zheleihuahewudouyoushuangsuoniaofanying。ziseluohewuyansedeshenqianyudanbaizhinongduchengzhengbi，eryudanbaizhifenziliangjianjisuanchengfenwuguan
，gukeyonglaiceliangdanbaizhihanliang。

適用性：用於快速測定，但不太靈敏;不同蛋白質顯色相似;誤差範圍為1~10µg蛋白質

③Folin-酚試劑法

原理：在堿性溶液中
，蛋白質中的肽鍵與銅鹽可產生雙縮脲反應，產生絡合物。此絡合物會將磷鉬酸-磷鎢酸試劑還原，產生深藍色複合物。在一定的條件下，藍色深淺與蛋白質的量成正比。在波長540nm處測定樣品的吸光度，與標準曲線對比
，可確定其蛋白質含量。

適用性：耗時長
，操作要嚴格計時;顏色深淺隨不同蛋白質變化，靈敏度高;最低位0~5µg;通常測定範圍是20~250µg;也適用於酪氨酸和色氨酸的定量測定。

④紫外吸收法

原理：蛋白質分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環含有共軛雙鍵，使蛋白質具有紫外吸收的性質

，吸收峰在280nm處，其吸光度與蛋白質含量成正比。此外，蛋白質溶液在280nm時的吸光度值與肽鍵含量成正比。利用一定波長下，蛋白質溶液的吸光度值與蛋白質濃度的正比關係，可進行蛋白質含量的測定。

適用性：用於層析注流出液的檢測;較為靈敏50~100µg;適用於與標準蛋白質氨基酸組成相似的蛋白質。

⑤考馬斯亮藍法

原理：考馬斯亮藍G-250染料，在酸性溶液中與蛋白質結合，使燃料的最大吸收峰位置λmax
，由465nm變為595nm，溶液的顏色也由棕黑色變為藍色，在595nm下測定的吸光度值，與蛋白質濃度成正比。

適用性：幹擾物質少，顏色穩定
，顏色深淺隨不同蛋白質變化;靈敏度最高為1~5µg。

2
、 使用分光光度計時應注意哪些問題?

答：分光光度計特點：準確度高
，測量範圍廣，在一定條件下可同時測定水樣中兩種或兩種以上的物質組成含量。

注意：①使用前
，仔細閱讀其使用說明書;②若大幅度改變測試波長

，需稍等片刻
，等燈熱平衡後，重新調零及滿度後，再測量;③指針式儀器在未接通電源時，電表的指針必須位於零刻度，若不是，則需進行機械調零;④操作人員不宜輕易觸動燈泡及反光鏡燈，以免影響光效率;⑤放大其靈敏度換擋後，必須重新調零;⑥比(bi)色(se)皿(min)使(shi)用(yong)時(shi)需(xu)注(zhu)意(yi)方(fang)向(xiang)性(xing)，並(bing)應(ying)配(pei)套(tao)使(shi)用(yong)
，以(yi)延(yan)長(chang)其(qi)使(shi)用(yong)壽(shou)命(ming)，使(shi)用(yong)完(wan)畢(bi)後(hou)，應(ying)立(li)即(ji)用(yong)蒸(zheng)餾(liu)水(shui)衝(chong)洗(xi)幹(gan)淨(jing)，並(bing)用(yong)幹(gan)淨(jing)柔(rou)軟(ruan)的(de)紗(sha)布(bu)擦(ca)水(shui)跡(ji)，以(yi)防(fang)表(biao)麵(mian)光(guang)潔(jie)度(du)被(bei)破(po)壞(huai)。