要求學會植物病原真菌、細菌、病毒和線蟲的分離、培養和接種的一般方法
，並掌握其基本原理；學習植物傳染性病害研究中常用的接種方法
，比較不同接種方法對病害發生發展過程與外界環境的差異。

二、材料和用具

新鮮的真菌和細菌病害材料（辣椒炭疽病果、水稻稻瘟病病葉片、水稻白葉枯病葉、煙草花葉病和番茄根結線蟲病等）
；番茄青枯菌/番茄、水稻稻瘟菌/水稻幼苗
、水稻白葉枯病菌/稻苗、煙草花葉病/煙草  

噴霧器
、紗布
、酒精燈、酒精缸
、火柴、接種餌（針）
、長鑷子、玻棒、小木塊、解剖刀、刀片、載玻片、蒸餾水（滴瓶）
、漂白粉精片兩研缸、漏鬥
、皺紋紙、毛筆、針、剪刀、三角瓶、試管、記號筆、標簽、金剛砂、保濕罩、彌霧機。70％乙醇、0．1％升汞
、滅菌培養皿（吸管）、滅菌水、滅菌培養基（PDA和NA）。

三、內容與方法

3．1 病原真菌的分離和培養 植(zhi)物(wu)病(bing)原(yuan)微(wei)生(sheng)物(wu)分(fen)離(li)和(he)培(pei)養(yang)工(gong)作(zuo)應(ying)該(gai)在(zai)專(zhuan)門(men)的(de)無(wu)菌(jun)操(cao)作(zuo)室(shi)或(huo)超(chao)淨(jing)工(gong)作(zuo)台(tai)上(shang)進(jin)行(xing)
，但(dan)是(shi)亦(yi)可(ke)在(zai)清(qing)潔(jie)和(he)安(an)靜(jing)的(de)房(fang)間(jian)中(zhong)進(jin)行(xing)。工(gong)作(zuo)時(shi)在(zai)桌(zhuo)麵(mian)上(shang)鋪(pu)一(yi)塊(kuai)沾(zhan)濕(shi)的(de)紗(sha)布(bu)
，所(suo)有(you)工(gong)作(zuo)用(yong)具(ju)放(fang)在(zai)濕(shi)紗(sha)布(bu)上(shang)
，盡(jin)量(liang)少(shao)在(zai)室(shi)內(nei)走(zou)動(dong)
，減(jian)少(shao)空(kong)氣(qi)流(liu)動(dong)
，以(yi)減(jian)少(shao)汙(wu)染(ran)。選(xuan)用(yong)的(de)分(fen)離(li)材(cai)料(liao)應(ying)盡(jin)量(liang)新(xin)鮮(xian)，減(jian)少(shao)腐(fu)生(sheng)菌(jun)混(hun)入(ru)的(de)機(ji)會(hui)。從(cong)受(shou)病(bing)組(zu)織(zhi)邊(bian)緣(yuan)靠(kao)近(jin)健(jian)全(quan)組(zu)織(zhi)的(de)部(bu)分(fen)分(fen)離(li)，可(ke)減(jian)少(shao)汙(wu)染(ran)
，同(tong)時(shi)這(zhe)部(bu)分(fen)病(bing)原(yuan)生(sheng)物(wu)處(chu)於(yu)較(jiao)為(wei)活(huo)動(dong)的(de)狀(zhuang)態(tai)，生(sheng)長(chang)快(kuai)，易(yi)分(fen)離(li)成(cheng)功(gong)。

植物病原真菌的分離有組織分離法和稀釋分離法兩種，在病組織上產生大量孢子的病原真菌以及病原細菌的分離都可用稀釋分離法。

3．1．1 組織分離法 按照以下步驟進行：

（1）培養皿準備：取滅菌培養皿一個，置於濕紗布上，在皿蓋上注明分離日期、材料和分離人姓名。  

（2）培養皿平板製備：用無菌操作法向培養皿中加入25％乳酸1－2滴（減少細菌汙染），然後將熔化而冷至45℃左右的馬鈴薯瓊膠培養基一管倒入培養皿中，輕輕搖動使成平麵（分離細菌時則不能加乳酸）。  

（3）切取病組織小塊（葉斑病類）：取新鮮病葉

，選擇典型的單個病斑
，用剪刀或解剖刀從病斑邊緣切取小塊（每邊長約3―5毫米）病組織數塊。

（4）表麵消毒：將病組織小塊放入70％酒精中浸數秒鍾後
，按無菌操作法將病組織移入0.1％升汞液中消毒1―3分鍾，然後放入滅菌水中連續漂洗三次。也可用漂白粉精片（1－2片），研磨後加滅菌水10ml
，消毒5―10分鍾。果實、塊莖和枝稈等組織內部的病原菌可用脫脂棉蘸70％酒精塗拭病部表麵，通過火焰燒去表麵酒精，重複進行2－3次
，達到表麵消毒。  

（5）用無菌操作法將病組織小塊移至培養基平麵上，每培養皿內可放4－5塊。  

（6）翻轉培養皿
，放入26－28℃恒溫箱內培養，3―4日後觀察結果。  

（7）用yong無wu菌jun操cao作zuo法fa自zi培pei養yang皿min中zhong選xuan擇ze菌jun落luo，挑tiao取qu少shao許xu菌jun絲si及ji孢bao子zi，在zai顯xian微wei鏡jing下xia觀guan察cha。如ru係xi玉yu米mi小xiao斑ban病bing菌jun孢bao子zi，即ji可ke用yong接jie種zhong針zhen自zi菌jun落luo邊bian緣yuan挑tiao取qu小xiao塊kuai菌jun落luo移yi入ru斜xie麵mian培pei養yang基ji，在zai26－28℃恒溫箱內培養，3－4天(tian)後(hou)，觀(guan)察(cha)菌(jun)落(luo)生(sheng)長(chang)情(qing)況(kuang)

，如(ru)無(wu)雜(za)菌(jun)生(sheng)長(chang)，即(ji)得(de)玉(yu)米(mi)小(xiao)斑(ban)病(bing)菌(jun)純(chun)菌(jun)種(zhong)，可(ke)置(zhi)於(yu)冰(bing)箱(xiang)中(zhong)保(bao)存(cun)。如(ru)有(you)雜(za)菌(jun)生(sheng)長(chang)
，需(xu)再(zai)次(ci)分(fen)離(li)獲(huo)純(chun)培(pei)養(yang)後(hou)，方(fang)可(ke)移(yi)入(ru)斜(xie)麵(mian)保(bao)存(cun)。

3．1．2 稀釋分離法

以棉花紅腐病果為材料，按照下列步驟分離：

（1）取滅菌培養皿三個，平放在濕紗布上，分別編號（1 、2、3），並注明日期

、分離材料及分離者姓名。  

（2）用滅菌吸管吸取滅菌水，在每一培養皿中分別注入0．5－1．0ml滅菌水。  

（3）用滅菌接種餌從棉花紅腐病果上刮取病菌孢子，放入培養皿內的水滴中
，配成孢子懸浮液。  

（4）yongjiezhongerzhanyierbaozixuanfuye，yudiyigepeiyangminzhongdemiejunshuihunhe
，zaicongdiyigepeiyangminyisanerbaozixuanfuyedaodiergepeiyangminzhong
，hunhehouzaiyisanerbaozixuanfuyedaodisangepeiyangminzhong。meiciyijunqian，jiezhongerjunxuzaijiujingdenghuoyanshangshaoguo。 ˇ

（5）將三管熔化並冷卻到45℃左右的培養基，分別倒在三個培養皿中，搖動使培養基與稀釋的菌液充分混勻，平置冷卻凝固。  

（6）將培養皿翻轉後放入恒溫箱（26－28℃）中培養

，3－4天後觀察菌落生長情況。  

（7）獲純培養後，從菌落邊緣挑取菌絲塊移入斜麵培養3-4天後

，放入冰箱保存。  

要獲得純淨培養
，一般需經3次稀釋分離（重複3次）
，當培養物高度一致時才能作為純培養的菌種保存。

3．1．3 真菌的培養

植物病原真菌多為好氣性真菌
，在有豐富營養的培養基上能很好地生長，但它們對溫度的要求差異較大，絕大多數的真菌可以在20－30℃間正常生長，但少數要在15－20℃間才能正常生長
，少數真菌孢子必須在5℃左右的低溫下才能萌發。

3．2 病原細菌的分離與培養

病bing原yuan細xi菌jun的de分fen離li方fang法fa以yi稀xi釋shi分fen離li法fa和he劃hua線xian分fen離li法fa為wei最zui常chang用yong。在zai進jin行xing分fen離li之zhi前qian
，首shou先xian應ying對dui病bing材cai料liao作zuo細xi菌jun學xue初chu步bu診zhen斷duan，即ji經jing過guo鏡jing檢jian確que認ren有you噴pen菌jun現xian象xiang以yi後hou，才cai對dui該gai病bing組zu織zhi作zuo分fen離li（少數病例無噴菌現象）。

3．2．1 稀釋分離法

xishifenlifashizuijingdiandebiaozhunfenlifa，fangfayuzhenjunbaozixishifenlifajibenxiangtong，danyaojiangbingzuzhifangzaimiejunshuizhongyongmiejunbobangyansuibingrangzuzhisuikuaizaishuizhongjinpao30－60分鍾（在滅菌培養皿中研碎並浸泡），讓細菌充分釋放到滅菌水中成為細菌懸浮液再進行稀釋分離。  

3．2．2 劃線分離法

除去上述稀釋分離法以外，較為方便的方法是劃線分離法，步驟如下：

（1）預先把NA培養基倒在培養皿中，凝成平板後，翻轉放在30℃恒溫箱中4－6小時，使表麵沒有水滴凝結。  

（2）配製細菌懸浮液。  

（3）在培養皿蓋上寫上分離材料名稱
、日期和姓名。  

用滅菌的接種餌蘸取細菌懸浮液在幹燥的培養基平板表麵按圖17所示方法劃線。劃過第一次線後的接種環應放在火焰上燒過，冷卻後直接在第一次劃線的末端向另一方向劃線
，同上

，滅菌後再劃第三、第四次線。  

（4）翻轉培養皿，放在26－28℃恒溫箱中培養，2－3天後觀察有無細菌生長，在哪些地方有單菌落生長出來（C）。  

（5）zaixitiaoquxijundedanjunluoyizhishiguanxiemian，tongshizaiyongmiejunshuibadanjunluoxijunxishichengxuanfuyezuodiercihuaxianfenli。ruliangcihuaxianfenlisuodejunluoxingtaitezhengdouyizhi，bingyudianxingjunluotezhengxiangfu，jibiaomingyihuodechunpeiyang

，zuihaoyaojingguolianxusancidanjunluodefenli。quebaochunhua。

3．2．3細菌的培養

病原細菌的培養條件因種類不同而略異。棒杆菌屬細菌的生長適溫較低（20－23℃）；假單胞菌中的青枯菌類則要求在較高的溫度（35℃）下才能良好地發育；軟腐型歐氏杆菌在厭氧條件下生長比好氣條件下生長更快

，致病力更強。

3．3植物病毒分離和純化

植zhi物wu病bing毒du的de分fen離li和he純chun化hua比bi較jiao特te殊shu，由you於yu病bing毒du是shi專zhuan性xing寄ji生sheng物wu
，因yin此ci不bu能neng離li開kai活huo的de寄ji主zhu。操cao作zuo時shi雖sui然ran不bu需xu無wu菌jun操cao作zuo

，但dan仍reng必bi須xu實shi行xing嚴yan格ge的de隔ge離li以yi防fang止zhi汙wu染ran和he混hun雜za。 ′

以有花葉病症狀的煙草病葉為材料
，進行病毒的“單斑分離”與純化，步驟如下：  

（1）首先用肥皂水洗淨雙手

，特別注意刷去指甲內的汙染物。  

（2）采摘半片病葉放在消過毒的研缽中
，加磷酸緩衝液（0.01M PBS，pH7．2）  

1ml（5－6滴）
，研碎。  

（3）在供接種用的心葉煙幼苗和莧色藜幼苗健苗頂部平展葉片上，撒少許金剛砂（600目／英寸2），然後用手指蘸取病汁液輕輕塗抹葉片（摩擦接種），寫好標簽牌，插在盆缽中。  

（4）3分鍾後用自來水將接種葉衝洗幹淨，放在溫室中培養。  

（5）2-3天後在接種葉上即出現壞死性枯斑
，初為褪綠，後為黃白色。  

（6）剪下單個枯斑，再按上述方法接種健康的心葉煙和莧色藜幼苗
，使它再次出現形狀大小、色澤均一致的枯斑
，即為已經分離純化的病毒標樣。材料經快速幹燥後可置低溫下保存。  

（7）將jiang此ci枯ku斑ban病bing葉ye分fen別bie接jie種zhong到dao黃huang瓜gua或huo普pu通tong煙yan草cao上shang，又you可ke得de到dao係xi統tong的de花hua葉ye症zheng狀zhuang。不bu同tong的de病bing毒du接jie種zhong在zai不bu同tong的de寄ji主zhu植zhi物wu上shang會hui變bian現xian不bu同tong的de症zheng狀zhuang。選xuan用yong這zhe些xie特te定ding寄ji主zhu植zhi物wu作zuo為wei鑒jian別bie寄ji主zhu，進jin行xing病bing毒du和he病bing毒du病bing害hai的de診zhen斷duan，可ke做zuo出chu初chu步bu鑒jian定ding。將jiang病bing組zu織zhi汁zhi液ye接jie種zhong在zai枯ku斑ban寄ji主zhu上shang，根gen據ju枯ku斑ban的de特te征zheng
，還hai可ke進jin一yi步bu區qu分fen病bing毒du的de種zhong類lei，並bing作zuo為wei病bing毒du定ding量liang的de一yi種zhong簡jian易yi方fang法fa。

3．4 植物病原線蟲的分離

大部分植物寄生線蟲隻為害根部
，有些還是根內寄生的


，少數可為害地上莖、葉、花果。從有病植物材料中和土壤中分離線蟲的方法很多，它們各有優缺點
，常用的方法有漏鬥分離法、淺盤分離法、漂浮分離法等。

3．4．1 貝曼（Baermann）漏鬥分離法

操作簡單、方便，適於分離植物材料和土壤中較為活躍的線蟲。一般是選用一隻口徑為10－15cm塑料漏鬥，下接一段長約5－10crn帶有彈簧夾的乳膠管，漏鬥放在木架或鐵環上，漏鬥內盛滿清水
，病植物材料或土樣用雙層紗布包紮好，慢慢浸入清水中

，浸泡24小時後樣品中線蟲因喜水而從材料中遊到水中，並因自身重量逐漸沉落到漏鬥底部的橡皮管中，慢慢放出5ml管中水祥於離心管中
，在1500轉／分的離心機中離心3fenzhong，qingqushangcengshuiye，jiangdibuchendianwuliantongxianchongyiqidaozaibiaomianminhuojishuminzhong，zaijiepoujingxiajishu
，ranhoujiangxianchongtiaozhizhuangyougudingyedexiaoboguanzhongbeiyong。yangpincailiaoyekeyongyiwangshaigezailoudoukoushang，shishuimiannengyanmeicailiao，xianchongyekeyiyoulichulaibingchenjiangdaodibu。

3．4．2 淺盤分離法 用兩隻不鏽鋼淺套放在一起

，上麵一隻稱篩盤
，它的底部是篩網（10目／英寸2），下麵一隻淺盤略大些是盛水盤（底盤）。

將(jiang)特(te)製(zhi)的(de)線(xian)蟲(chong)濾(lv)紙(zhi)放(fang)在(zai)篩(shai)盤(pan)中(zhong)用(yong)水(shui)淋(lin)濕(shi)，上(shang)麵(mian)再(zai)放(fang)一(yi)層(ceng)餐(can)巾(jin)紙(zhi)，供(gong)分(fen)離(li)的(de)土(tu)樣(yang)或(huo)材(cai)料(liao)放(fang)在(zai)餐(can)巾(jin)紙(zhi)上(shang)，在(zai)兩(liang)盤(pan)之(zhi)間(jian)隙(xi)縫(feng)中(zhong)加(jia)水(shui)浸(jin)沒(mei)材(cai)料(liao)
，在(zai)室(shi)溫(wen)（20℃以上）下保持8天，材料中的線蟲大都能穿過濾紙而進入托盤水中，收集淺盤中的水樣通過二個小篩子（上層為25目粗篩，下層為400目細篩）。線蟲大多集中在下層篩上，可用小水流衝洗到計數皿中。  

淺盤法比漏鬥法好，它可以分離到較多的活蟲

，而且泥沙等雜物較少。

3．4．3 胞囊漂浮器分離法（Fenwick－Oostenbrink改良漂浮法）

對於沒有活動能力的線蟲胞囊可采用Fenwick漂浮筒漂浮的方法分離，筒內先盛滿清水
，把10.0gfenggantuyangfangzaidingshaizhong。yongqiangshuiliuchongxituyang，shiquanbulinrutongnei，zaiyongxishuiliucongdingshaijiaru
，shitulidengzawuchenrutongdi，baonanghecaozhadengzezhujianpiaofuqilaiyanyikouqingxiedehuancaoliudaochengjieshaizhong（100目）,先把篩中胞囊等沈入燒杯中，再倒入鋪有濾紙的漏鬥中，收集濾紙上的胞褒。  

在解剖鏡或擴大鏡下，學習用鑷子
、毛針、竹針
、毛筆等工具從水樣或濾紙上挑取線蟲。

3.5 拌種法和浸種法 種zhong子zi傳chuan染ran的de病bing害hai可ke采cai用yong這zhe兩liang種zhong接jie種zhong方fang法fa。拌ban種zhong法fa是shi將jiang病bing菌jun的de懸xuan浮fu液ye或huo孢bao子zi粉fen拌ban和he在zai植zhi物wu種zhong子zi上shang
，然ran後hou播bo種zhong誘you發fa病bing害hai。小xiao麥mai腥xing黑hei穗sui病bing可ke采cai用yong此ci法fa接jie種zhong。浸jin種zhong法fa是shi用yong孢bao子zi或huo細xi菌jun懸xuan浮fu液ye浸jin種zhong後hou播bo種zhong
，大da麥mai堅jian黑hei穗sui病bing、棉花炭疽病和菜豆疫病可用此法接種。

3.6 土壤接種法 由糞肥、turangchuanrandebinghaikeyicaiyongbantujiezhongfa。turangjiezhongfashijiangrengongpeiyangdebingjunhuojiangdaijundezhiwufensui，zaibozhongqianhuobozhongshishiyuturangzhong
，ranhoubozhong。yekexiankaigou，goudisa－層病殘體或菌液
，將種子播在病殘體上
，再蓋土。  

有的病原物能在土壤中長期存活（土壤習居菌）

，把帶菌土攘或帶有線蟲接種體的土樣接種到無菌（蟲）土中，再栽種植物
，就可以使植物感染

，如棉花枯黃萎病、小麥土傳花葉病毒和一些線蟲病等。對於青枯菌可以采用土壤灌根的方法。

3．7噴霧法和噴撒法 這兩種方法適用於氣流和雨水傳染的病害，大部分細菌病害和真菌葉部病都可采用噴霧接種，如水稻細菌性條斑病、玉米大斑病、小斑病。將接種用的病菌配成一定濃度的懸浮液，用噴霧器噴灑在待接種的植物體上

，在一定的溫度下保濕24小時
，誘發病害。

3．8傷口接種 除了植物病毒接種時常用的摩擦接種屬傷口接種之外
，植物病原細菌、病原真菌也常用傷口接種法。許多由傷口侵入
，導致果實、塊根、塊莖等腐爛的病害均可采用。先將接種用的瓜果等洗淨，用70％酒精表麵消毒
，再用滅菌的接種針或滅菌的小刀刺傷或切傷接種植物，滴上病菌懸浮液或塞入菌絲塊
，用濕脫脂棉覆蓋接種處保濕。  

水稻白葉枯病的傷口接種常用剪葉接種和針刺接種法。先通過火焰或用75％酒(jiu)精(jing)消(xiao)毒(du)解(jie)剖(pou)剪(jian)
，將(jiang)剪(jian)刀(dao)在(zai)白(bai)葉(ye)枯(ku)病(bing)菌(jun)懸(xuan)浮(fu)液(ye)中(zhong)浸(jin)一(yi)下(xia)，使(shi)剪(jian)刀(dao)的(de)刃(ren)口(kou)蘸(zhan)滿(man)菌(jun)液(ye)，再(zai)將(jiang)要(yao)接(jie)種(zhong)的(de)稻(dao)葉(ye)葉(ye)尖(jian)剪(jian)去(qu)。接(jie)種(zhong)處(chu)不(bu)必(bi)保(bao)濕(shi)，定(ding)期(qi)觀(guan)察(cha)病(bing)情(qing)。細(xi)菌(jun)懸(xuan)浮(fu)液(ye)的(de)濃(nong)度(du)為(wei)108cfu／ml。

3．9 介體接種

3．9．1 菟絲子接種 在溫室中研究病毒、junyuantidengbinghaiguangweicaiyongdeyizhongjiezhongfangfa，xianrangtusiziqinranbingzhu，daijianlijishengguanxihuojinyibushenchangyihou，zairangbingzhushangdetusiziqinranjianzhu
，shibinghaitongguotusizijiezhongchuanbodaojiankangzhizhushang。

 

3．9．2 蚜蟲及其他介體昆蟲接種 詳見植物病毒的傳染方法。

所有的接種實驗都應設有對照，即用清水代替病菌，用同樣的方法接種，觀察發病與否。  

分別用土壤灌根法接種番茄青枯菌
、用噴霧接種法接種水稻稻瘟病菌、用剪葉接種的方法接種水稻白葉枯病菌


，注意針對不同病害接種後培養的條件，觀察不同病害症狀出現的過程。

四、 作業與思考題

（1）以小組為單位進行接種，每一組做一套


，每人每天自己負責觀察記載。  

（2）用所給的新鮮病害材料，進行真菌和細菌病原菌的分離和純化，觀察並記載分離物的培養性狀。  

（3）用分離到的病毒標樣接種1－2個鑒別寄主，並記載寄主反應類型。  

（4）為什麼要分離並純化病原物？  

（5）是否所有的病害都能分離到病原物？為什麼
？  

（6）接種的目的是什麼

？ ｜  

（7）接種後的植株應怎樣培養？  

（8）如果隻有一個噴霧器，應先接病菌還是先接對照（水）
？為什麼？