一、器材與試劑： 

幹粉型培養基、胰蛋白酶，青黴素
、鏈黴素. 純淨水係統、電子天平、PH計、磁力攪拌器。

具體步驟：

（1）水的製備：

細胞培養用水必須非常純淨，不含有離子和其他的雜質。需要用新鮮的雙蒸水、三蒸水或純淨水.

（2）PBS的製備與消毒（也可用於其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配製）：

1.溶解定容：將藥品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4·H2O 1.56g，KH2PO4 0. 2g ）倒入盛有雙蒸水的燒杯中，玻璃棒攪動
，充分溶解，然後把溶液倒入容量瓶中準確定容至1000ml，搖勻即成新配製的PBS溶液。

2.移入溶液瓶內待消毒：將PBS倒入溶液瓶（大的吊針瓶）內，蓋上膠帽，並插上針頭放入高壓鍋內8磅消毒20分鍾。注意高壓消毒後要用滅菌蒸餾水補充蒸發掉的水份。

（3） 胰蛋白酶溶液的配製與消毒：

yidanbaimeidezuoyongshishixibaojiandedanbaizhishuijiecongershixibaolisan。butongdezuzhihuozhexibaoduiyimeidezuoyongfanyingbuyiyang。yimeifensanxibaodehuoxinghaiyuqinongdu、溫度和作用時間有關
，在pH為8.0、溫度為37℃時，胰酶溶液的作用能力最強。使用胰酶時，應把握好濃度、溫度和時間，以免消化過度造成細胞損傷。因Ca2+
、Mg2+和血清、蛋白質克降低胰酶的活性，所以配製胰酶溶液時應選用不含Ca2+ 
、Mg2+的BSS

，如：D-Hanks液。終止消化時，可用含有血清培養液或者胰酶抑製劑終止胰酶對細胞的作用。

 

培養用液的配製與消毒1.稱取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液濃度為0.25％
，用電子天平準確稱取粉劑溶入小燒杯中的雙蒸水（若用雙蒸水需要調PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。攪拌混勻，置於4℃內過夜。

2.用注射濾器抽濾消毒：配好的胰酶溶液要在超淨台內用注射濾器（0.22微米微孔濾膜）抽濾除菌。然後分裝成小瓶於-20℃保存以備使用。

（4）青、鏈黴素溶液的配製於消毒

1.所用純淨水（雙蒸水）需要15磅高壓20分鍾滅菌。

2.具體操作均在超淨台內完成。青黴素是80萬單位/瓶，用注射器加4ml滅菌雙蒸水。鏈黴素是100萬單位/瓶
，加5ml滅菌雙蒸水
，即每毫升各為20萬單位。

3.使用時溶入培養液中，使青鏈黴素的濃度最終為100單位/ml。1單位＝1微克

（5）RPMI1640的製備與消毒：

1.溶解、調PH值
、定容：先將培養基粉劑加入培養液體積2/3的雙蒸水中,並用雙蒸水衝洗包裝袋2-3次（衝洗液一並加入培養基中）,充分攪拌至粉劑全部溶解,並按照包裝說明添加一定的藥品.然後用注射器向培養基中加入配製好的青鏈黴素液各0.5ml, 使青鏈黴素的濃度最終各為100單位/ml。然後用一個當量的鹽酸和NaOH調PH到7.2左右。最後定容至1000ml，搖勻。

2.安裝蔡式濾器：安裝時先裝好支架
，按規定放好濾膜，用螺絲將不鏽鋼濾器和支架連接好。然後卸下支架腿分別用布包好待消毒。

3.抽濾：配製好的培養液通常用濾器過濾除菌。通常用蔡式濾器在超淨工作台內過濾。

4.分裝：將過濾好的培養液分裝入小瓶內置於4℃冰箱內待用。

5.使用前要向100ml培養液中加入1ml穀氨酰胺溶液（4℃時兩周有效）。

（6）血清的滅活：

細胞培養常用的是小牛血清
，新買來的血清要在56℃水浴中滅活30分鍾後，再經過抽濾方可加入培養基中使用。

（7）HEPES溶液：

HEPES的化學全稱位羥 （N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid ）。對細胞無毒性作用。它是一種氫離子緩衝劑，能較長時間控製恒定的pH範圍。使用終濃度為10-50mmol/L，一般培養液內含20mmol/LHEPES即可達到緩衝能力。

1mol/L HEPE緩衝液配製方法如下：

準確稱取HEPTS 238.3g，加入新鮮三蒸水定容至1L。過濾除菌
，分裝後4℃保存。

注意：因為現在市售HEPES為約10g包裝的小瓶，所以可根據實際情況靈活配製
，但是要保證培養液內HEPES的終濃度仍然為20m mol/L 。如：稱取4.766克HEPES溶於20ml三蒸水中，過濾除菌後可完全（20ml）加入1L培養液中，或者每100ml培養液中加入2ml即可。

 

培養用液的配製與消毒（8）穀氨酰胺：

合(he)成(cheng)培(pei)養(yang)基(ji)中(zhong)都(dou)含(han)有(you)較(jiao)大(da)量(liang)的(de)穀(gu)氨(an)酰(xian)胺(an)，其(qi)作(zuo)用(yong)非(fei)常(chang)重(zhong)要(yao)，細(xi)胞(bao)需(xu)要(yao)穀(gu)氨(an)酰(xian)胺(an)合(he)成(cheng)核(he)酸(suan)和(he)蛋(dan)白(bai)質(zhi)，穀(gu)氨(an)酰(xian)胺(an)缺(que)乏(fa)要(yao)導(dao)致(zhi)細(xi)胞(bao)生(sheng)長(chang)不(bu)良(liang)甚(shen)至(zhi)死(si)亡(wang)。在(zai)配(pei)製(zhi)各(ge)種(zhong)培(pei)養(yang)液(ye)中(zhong)都(dou)應(ying)該(gai)補(bu)加(jia)一(yi)定(ding)量(liang)的(de)穀(gu)氨(an)酰(xian)胺(an)。由(you)於(yu)穀(gu)氨(an)酰(xian)胺(an)在(zai)溶(rong)液(ye)中(zhong)很(hen)不(bu)穩(wen)定(ding)，4℃下放置1周可分解50％，故應單獨配製
，置於-20℃冰箱中保存，用前加入培養液。加有穀氨酰胺的培養液在4℃冰箱中儲存2周以上時，應重新加入原來的穀氨酰胺。

一般培養液中穀氨酰胺的含量為1～4mmol/L。可以配製200mmol/L穀氨酰胺液貯存
，用時加入培養液。配製方法為，穀氨酰胺2.922g溶於三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分攪拌溶解後
，過濾除菌，分裝小瓶，-20℃保存，使用時可向100ml培養液中加入1ml穀氨酰胺溶液。

（9）肝素溶液的配製：

含有肝素的培養液可以使內皮細胞純度提高，肝素加入全培養液中最終濃度為50ug/ml。因為現在市售的多為肝素鈉
，包裝為約為0.56克/瓶，配製時，可將其溶於100ml三蒸水中
，定容
，過夜
，然後過濾除菌，分裝小瓶，保存溫度為­­ ℃ 。使用時，向100ml培養液中加入1ml（精確可加入0.9ml）即可。

（10） Ⅰ型膠原酶：

0.1％Ⅰ型膠原酶溶液同胰蛋白酶一樣配製和消毒滅菌。注意：因為Ⅰ型膠原酶分子顆粒比胰酶大，不容易過濾，因此可以用蔡式濾器過濾除菌。分裝入10ml小瓶-20℃保存。

（11）明膠溶液：

因為明膠難於過濾，所以配製0.1％明膠溶液必須用無菌的PBS配製。所以製備過程中必須要注意無菌操作。首要的問題是如何無菌準確稱量0.1克（配成100ml溶液）—即解決無菌分裝藥品的問題。其次要注意即使是0.1%的溶液
，明膠也難溶，因此要充分搖勻，過夜放置

，然後無菌分裝入50ml小瓶中，4℃保存。

（12）其他培養用液的配製：

20ug/ml內皮生長因子，

注意事項：

1.配製溶液時必須用新鮮的蒸餾水。

2.安裝蔡式濾器時通常使用孔徑0.45微米和0.22微米濾膜各一張，放置位置為0.45的位於0.22微米的濾膜上方，並且要特別注意濾膜光麵朝上。

3.配製RPMI1640培養基時因為還要加入小牛血清，而小牛血清略偏酸性，為了保證培養液PH值最終為7.2，可在配製時調PH至7.4。