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內容提要
本文內容共分為【四個部分】
1、標準曲線的本質：係列濃度待測物質與響應的關係，用以推算樣品含量。
2、標準曲線的做法：3點以上，至少重複2次，濃度均勻設置。
3、標準曲線的檢驗：擬合檢驗、失擬檢驗和斜率、截距檢驗。
4、標準曲線使用中的問題。
標準曲線的本質
分析檢測中的標準曲線是指一係列已知含量（濃度/量）的物質與儀器響應/xinhaozhijiandeguanxi，shuxuechulijiushiquxianfangcheng，tuxingbiaoshijiushibiaozhunquxian。biaozhunquxiandemudeshikeyigenjubiaozhunquxianzhachudaicewuzhidehanliang。dangwomendedaoyixilieyizhihanliangdewuzhidexiangyinghou，jiuhuiqujianlihanshuguanxi，shuxueshangchengquxiannihe，youyuzhixianzuiweijiandan，suoyichangchangyongzhixianfangchengjiayinihe，dangranhuiyongdaoduoxiangshinihedengqitafangshi。
標準曲線的核心問題要解決：1、能找到確切濃度的標準物質或標準品。2、標biao準zhun係xi列lie和he待dai測ce物wu質zhi一yi定ding要yao有you相xiang同tong和he一yi致zhi的de基ji體ti，因yin為wei樣yang品pin基ji體ti可ke能neng會hui幹gan擾rao儀yi器qi的de響xiang應ying，從cong這zhe個ge意yi義yi上shang講jiang，樣yang品pin的de前qian處chu理li實shi際ji就jiu是shi提ti供gong標biao準zhun和he樣yang品pin同tong樣yang的de基ji體ti環huan境jing，盡jin量liang祛qu除chu幹gan擾rao基ji體ti。所suo以yi最zui好hao的de標biao準zhun係xi列lie應ying該gai是shi樣yang品pin基ji體ti匹pi配pei的de標biao準zhun係xi列lie。而er方fang法fa建jian立li過guo程cheng中zhong首shou先xian要yao考kao慮lv的de當dang然ran是shi基ji體ti幹gan擾rao的de問wen題ti，推tui薦jian用yong標biao準zhun加jia入ru曲qu線xian和heYouden曲qu線xian分fen別bie考kao察cha樣yang品pin基ji體ti所suo帶dai來lai的de乘cheng積ji性xing幹gan擾rao和he加jia和he性xing幹gan擾rao。標biao準zhun加jia入ru曲qu線xian就jiu是shi在zai樣yang品pin中zhong加jia入ru一yi係xi列lie標biao準zhun，然ran後hou考kao察cha該gai標biao準zhun加jia入ru曲qu線xian和he標biao準zhun曲qu線xian斜xie率lv的de統tong計ji學xue差cha異yi，若ruo有you差cha異yi需xu考kao慮lv用yong標biao準zhun加jia入ru法fa定ding量liang；而Youden曲線就是對樣品做一係列稀釋，然後用稀釋倍數如1/10,1/5,1/2,1對儀器響應做曲線，考察該Youden曲線的截距與0的(de)差(cha)別(bie)，若(ruo)有(you)差(cha)別(bie)則(ze)提(ti)示(shi)有(you)加(jia)和(he)性(xing)幹(gan)擾(rao)，此(ci)時(shi)測(ce)定(ding)值(zhi)要(yao)減(jian)去(qu)該(gai)截(jie)距(ju)才(cai)是(shi)真(zhen)實(shi)值(zhi)。隻(zhi)有(you)解(jie)決(jue)了(le)標(biao)準(zhun)曲(qu)線(xian)與(yu)樣(yang)品(pin)基(ji)體(ti)的(de)匹(pi)配(pei)問(wen)題(ti)，我(wo)們(men)的(de)定(ding)量(liang)才(cai)可(ke)靠(kao)。內(nei)標(biao)法(fa)和(he)替(ti)代(dai)物(wu)的(de)使(shi)用(yong)則(ze)是(shi)為(wei)了(le)解(jie)決(jue)儀(yi)器(qi)和(he)前(qian)處(chu)理(li)的(de)影(ying)響(xiang)問(wen)題(ti)。
標準曲線的做法
按GB/T22554-2010《基於標準樣品的線性校準》推薦：
1、標準曲線的濃度範圍應覆蓋正常操作條件下的被測量範圍；
2、標準樣品的組分盡量與被測樣品組分一致；
3、標準樣品的濃度值應等距離的分布在被測量範圍；
4、標準樣品的個數至少應有3個濃度；
5、每個標準點至少重複2次，這個重複是指從稀釋開始。
如果國家標準有相應的濃度係列推薦，盡量按國家標準，如果你要偷懶，比如我要減少標準點，至少要有理論標準支撐，比如至少要3個濃度。工作中我們經常采用線性校準，因為線性方程最為簡潔。
標準曲線的檢驗
標準曲線的檢驗是實際操作中最大的難點，也是工作中誤區和爭議最多的話題，比如GB/T 5750.3-2006 就將標準曲線的檢驗分為：精jing密mi度du檢jian驗yan，截jie距ju檢jian驗yan和he斜xie率lv檢jian驗yan，但dan並bing未wei出chu示shi具ju體ti的de檢jian驗yan方fang法fa。首shou先xian講jiang講jiang這zhe三san個ge檢jian驗yan，標biao準zhun曲qu線xian的de精jing密mi度du檢jian驗yan，實shi際ji含han義yi就jiu是shi做zuo出chu來lai的de試shi驗yan點dian在zai我wo擬ni合he的de直zhi線xian方fang程cheng左zuo右you的de分fen布bu情qing況kuang，標biao準zhun曲qu線xian是shi所suo有you點dian以yi最zui小xiao二er乘cheng算suan法fa（OLS）擬合出來的，這條曲線到所有點的垂直距離的和（殘差）是最小的。
因此這條曲線並非通過所有點而是非常接近所有點，精密度檢驗就是看這些試驗點距離擬合的直線的距離有無異常，所以也稱線性檢驗（擬合檢驗）。這時的精密度（線性檢驗）需用F檢驗，P<0.05作為線性檢驗合格的標準。
標準曲線的截距檢驗和斜率檢驗分別考察Y=a+bX中a和b與0的統計學差異，a與0有差別說明有試劑空白或係統誤差，而b若與0meichabieshuomingyiqidelingmindugenbendabudaofenxiyaoqiu。richanggongzuozhongwomentongchangyongxiangguanxishulaizuoweibiaozhunquxianhaohuaidebiaozhun，zhedianyouyidingdaoli，danbingbuquanmian。
決定係數是相關係數的平方，就是我們經常在儀器軟件中看到的R2或Fit，它提示的是我建立的回歸方程所解釋X對Y變化占Y變量的比值，比如決定係數是0.99也就是說我這個回歸方程可以解釋Y變化的99%，剩下的1%就是殘差。前麵提到的精密度（線性檢驗）就是用這兩部分的變化做F檢驗，由於統計檢驗的臨界值比較大，通常0.90以上的相關係數都會通過這個F檢驗，當然還與實驗點數（自由度）有關。
這裏要提到GB/T22554-2010《基於標準樣品的線性校準》中關於失擬檢驗的問題，這裏的失擬檢驗是要看曲線擬合後剩下殘差與實驗數據本身隨機誤差（變異）之間的差別，同樣采用F檢驗，此時失擬檢驗P應該>0.05，也就是說殘差應該跟實驗測定中的隨機誤差（變異）沒有差別，你要看每次測定的隨機誤差（變異）就必須多次測定同一濃度，因此失擬檢驗要求每個濃度點至少重複2次。
chucizhiwai，zuihouwomenhaiyaokankanzhexiecanchadefenbushifoushizhengtaide，yinweizhengtaicaifuhesuijiwuchadetexing。zongshangsuoshu，biaozhunquxiandejianyanyinggaishixianxingjianyanjieheshinijianyan，yijicanchadezhengtaixingjianyanjiehecaishitongjixueshangbijiaowanbeide。
通常我們采用的相關係數0.99yishangdeshuofaquefatongjiwanbeixing。zhengrudajiajingchangkandaodegaibiannihedecanshugeshu，ruercifangchengmingxiannengtigaoxiangguanxishu，danshiwomenjingchangmeiyouyongqiquyongerciquxianfangcheng，yinweinimeiyoutongjixueshangwanbeidezhicheng。ruguonifaxianbiaozhunquxianzaidinongduhegaonongdudiandebianyichengdubutong（非等方差），此時你應該考慮權重最小二乘(WLS)。
標準曲線使用中的問題
4.1 標準曲線需要人為的增加（0,0）點嗎？
不能。通常的標準係列多是配製0,1,2,3mg/L係列這樣的說法，沒做實驗人為添加（0,0）很不妥，因為很多時候0管進入儀器可能也有響應值，這也是我們考察試劑空白的一個重要步驟。這個0管在某些時候非常重要，比如全血鉛測定，我們采用牛血清來基體匹配標準係列，如果此時你用酸做空白或沒做實驗人為添加（0,0），那你就很難做好標準曲線。所以標準曲線的0管也是做好標準曲線的重要考慮點。
4.2 標準曲線需要減掉試劑空白來做嗎？
不需要。儀器測出來標準係列的響應值可以減掉試劑空白或減掉0管的響應值來做，工作中我們也常用0管來做儀器調零。其實沒有必要那麼麻煩，即使空白或0管有響應值，在構建標準曲線時，我們已經認為該響應值就是0濃度，也就是扣除了這個空白的。
4.3 什麼時候用Y=bX和二次曲線呢？
標準曲線我們通常采用的是Y=a+bX，曲線擬合完必須要做統計檢驗，且要做統計完備的線性檢驗和失擬檢驗，然後再做a與0的差別檢驗，如果a與0的統計學上無差異，你就可以考慮用Y=bX的擬合曲線，擬合出來後同樣做線性檢驗和失擬檢驗，如果線性檢驗合格（P<0.05）且失擬檢驗合格（p>0.05）此時你就可以采用Y=bX。二次曲線的采用同樣是這樣的道理，如果你Y=a+bX時擬合不合格，你就考慮用Y=a+bX+cX2，同樣做失擬檢驗，考察擬合的符合情況。如果Y=a+bX 和Y=a+bX+cX2都滿足擬合檢驗和失擬檢驗合格，則采用Y=a+bX形式，這樣符合統計學上參數最少的統計簡潔性原則。
4.4 標準曲線去查含量時是先減空白信號算樣品含量還是先算出空白含量相減呢？
工gong作zuo中zhong我wo們men常chang要yao減jian掉diao空kong白bai得de到dao樣yang品pin含han量liang，現xian有you國guo家jia標biao準zhun方fang法fa有you的de推tui薦jian先xian算suan出chu空kong白bai含han量liang，用yong樣yang品pin含han量liang相xiang減jian，也ye有you推tui薦jian先xian用yong樣yang品pin信xin號hao減jian空kong白bai信xin號hao然ran後hou去qu標biao準zhun曲qu線xian推tui算suan含han量liang。而er且qie這zhe兩liang種zhong算suan法fa常chang常chang差cha距ju很hen大da。其qi實shi這zhe種zhong差cha距ju往wang往wang是shi低di含han量liang水shui平ping時shi才cai出chu現xian，在zai低di含han量liang水shui平ping通tong過guo標biao準zhun曲qu線xian推tui算suan含han量liang時shi，本ben身shen不bu確que定ding度du就jiu很hen大da。這zhe兩liang種zhong方fang法fa都dou可ke以yi。個ge人ren推tui薦jian先xian用yong樣yang品pin信xin號hao減jian空kong白bai信xin號hao然ran後hou去qu標biao準zhun曲qu線xian推tui算suan含han量liang，因yin為wei這zhe樣yang出chu來lai的de含han量liang不bu確que定ding度du要yao小xiao一yi些xie，而er先xian算suan出chu空kong白bai含han量liang再zai相xiang減jian就jiu增zeng加jia了le1次標準曲線推算含量時的不確定度，因為好的測量永遠是不確定度小的測量。
4.5 如何做兩條標準曲線的檢驗呢？
先從原理上講：判斷兩條或多條標準曲線的差異，須檢驗殘差，截距和斜率三項，分別有不同的統計學參數，殘差用F檢驗，截距和斜率采用較為複雜的統計量。2、從實際操作講：多用協方差分析檢驗截距和斜率的差異，以SPSS為例：1.先重新整理數據,將y2數據列加到y1下麵,變成一個變量y;將x2數據列加到x1下麵,變成一個變量x;然後再設定一個新的分組變量group,原來第1組值為1,第2組值為2. 2.進行協方差分析(第一步分析斜率是否無差異).Analyze->GeneralLinear Model->Univariate Dependent List:填入y---------將y做為因變量 Fixed Factor:填入group Covaraites:填入x--------將x做為協變量 Model:選Custom Model:填入 x groupx*group---------注意如果變量填入順序不一樣,結果也會不一樣. Sum ofsquares下拉列表框:選TypeI 然後點擊ok,看結果裏x*group這一行的Sig.P值,若大於0.05,則接受原假設,即兩條回歸直線的斜率無差異,否則拒絕. 3.再來進行截距的無差異分析其實過程跟上麵一樣,隻是Model裏去掉了x*group交叉項.Analyze->GeneralLinear Model->Univariate Dependent List:填入y---------將y做為因變量 Fixed Factor:填入group Covaraites:填入x--------將x做為協變量 Model:選Custom Model:填入 x group ---------注意如果變量填入順序不一樣,結果也會不一樣. Sum of squares下拉列表框:選TypeI 點擊ok後,看group一行的Sig.P值,若P值大於0.05說明兩條回歸直線截距也無差異,若小於0.05說明截距是有差異的。
4.6 標準係列的標準溶液體積取用中有效數字該如何寫呢？
標準溶液體積取用的有效數字跟你采用的體積量具有直接關係。比如說量取或準確量取等字眼，10mL和10.0mL提(ti)示(shi)你(ni)要(yao)采(cai)用(yong)不(bu)同(tong)的(de)量(liang)具(ju)。當(dang)我(wo)們(men)使(shi)用(yong)某(mou)個(ge)量(liang)具(ju)完(wan)成(cheng)某(mou)次(ci)體(ti)積(ji)取(qu)用(yong)後(hou)，讀(du)數(shu)是(shi)按(an)照(zhao)量(liang)具(ju)的(de)最(zui)小(xiao)允(yun)差(cha)決(jue)定(ding)的(de)，而(er)最(zui)小(xiao)允(yun)差(cha)是(shi)針(zhen)對(dui)最(zui)小(xiao)分(fen)度(du)線(xian)而(er)言(yan)的(de)。當(dang)取(qu)用(yong)10mL體積時，如果用A級10mL的分度吸管，那麼10.0mL應該是確定的，因為它的分度線為0.1mL。當取用1mL體積時，如果用A級1mL的分度吸管，那麼1.00mL應該是確定的，因為它的分度線為0.01mL。所以我個人意見，到底寫10.00還是10.0以最小分度線來確定，最小分度線以下的都為估讀。如果你認為估讀也是有效數字的話，10.00mL也可以，因為此時的容量允差為0.05mL，但1.000mL就沒有太大意義了，因為A級1mL的分度吸管的容量允差已經是0.008mL了。
4.7 標準曲線的相關係數的有效數字該如何保留呢？
GB5750.3-20068.2.7項有如下規定：校準曲線相關係數隻舍不入，保留到小數點後出現非9的一位，如0.99989→0.9998。如果小數點後都是9時，最多保留小數點後4位。
4.8 標準曲線可以用同一濃度不同體積的進樣來做嗎？
標準係列一般都是配製不同濃度，進樣相同體積來做的（濃度法）。但實際工作中我們還用到同一濃度來進樣不同體積的方式來做（體積法），濃度法與體積法的區別在於濃度法中與待測物質存在的溶劑/待測物質的比例與體積法不同。濃度法中溶劑的環境（體積）基本是一致的，這樣的好處就是濃度法在判斷溶劑（或溶劑中幹擾物質）和he待dai測ce物wu質zhi的de指zhi認ren上shang更geng加jia容rong易yi。體ti積ji法fa中zhong幹gan擾rao物wu質zhi也ye會hui隨sui標biao準zhun係xi列lie增zeng加jia，不bu容rong易yi實shi現xian待dai測ce物wu質zhi的de指zhi認ren。從cong進jin樣yang針zhen，進jin小xiao體ti積ji時shi不bu確que定ding度du比bi較jiao大da，帶dai來lai的de直zhi接jie結jie果guo時shi標biao準zhun曲qu線xian不bu如ru濃nong度du法fa容rong易yi做zuo直zhi。而er且qie物wu理li體ti積ji的de限xian製zhi，體ti積ji法fa不bu太tai容rong易yi實shi現xian較jiao大da跨kua度du的de濃nong度du係xi列lie設she置zhi。總zong之zhi，體ti積ji法fa和he濃nong度du法fa本ben質zhi上shang是shi一yi致zhi的de，但dan濃nong度du法fa有you：容易做好標準曲線，容易實現較大濃度跨度和容易實現待測物質的指認等優點。
4.9 標準曲線查出樣品是負值，如何報告結果呢？
這種情況下我們一般選擇四種方式報告結果：未檢出，<檢出限，<定量限，
定量限是可以定量檢出的標誌，其RSD定為10%，其II類錯誤比檢出限小很多。<標準曲線第一點所推算的樣品濃度，是我們儀器比較可信的測定濃度。總之，報告<檢出限，<定量限，<標準曲線第一點所推算的樣品濃度所犯I類和II類(lei)錯(cuo)誤(wu)依(yi)次(ci)降(jiang)低(di)，但(dan)如(ru)果(guo)這(zhe)個(ge)報(bao)告(gao)結(jie)果(guo)已(yi)經(jing)超(chao)過(guo)你(ni)要(yao)判(pan)斷(duan)的(de)限(xian)值(zhi)，那(na)麼(me)你(ni)的(de)檢(jian)測(ce)就(jiu)一(yi)點(dian)意(yi)義(yi)都(dou)沒(mei)有(you)了(le)。所(suo)以(yi)現(xian)在(zai)的(de)檢(jian)測(ce)單(dan)位(wei)甚(shen)至(zhi)直(zhi)接(jie)報(bao)告(gao)小(xiao)於(yu)國(guo)家(jia)標(biao)準(zhun)規(gui)定(ding)的(de)限(xian)值(zhi)，從(cong)概(gai)率(lv)統(tong)計(ji)的(de)角(jiao)度(du)講(jiang)，它(ta)犯(fan)錯(cuo)誤(wu)的(de)幾(ji)率(lv)最(zui)小(xiao)，但(dan)又(you)解(jie)決(jue)了(le)客(ke)戶(hu)的(de)檢(jian)測(ce)問(wen)題(ti)。
4.10 空白測出來是負值，該不該減呢？
空白代表你所選擇的空白對儀器響應/信(xin)號(hao)的(de)影(ying)響(xiang)，當(dang)然(ran)可(ke)能(neng)是(shi)正(zheng)方(fang)向(xiang)和(he)負(fu)方(fang)向(xiang)的(de)影(ying)響(xiang)，所(suo)以(yi)理(li)論(lun)上(shang)講(jiang)必(bi)須(xu)減(jian)掉(diao)空(kong)白(bai)。至(zhi)於(yu)是(shi)先(xian)減(jian)空(kong)白(bai)信(xin)號(hao)，還(hai)是(shi)減(jian)空(kong)白(bai)測(ce)定(ding)值(zhi)，按(an)國(guo)家(jia)規(gui)定(ding)或(huo)參(can)見(jian)4.4問題。
4.11 線性範圍（動態範圍）的最低點和最高點如何確定呢？
配置一係列濃度標準，包括0濃度，從低濃度開始擬合當擬合檢驗出現P>0.05的最高的那個濃度點為止。有也經驗說當加入的高濃度點在低濃度點構建的直線方程推算的響應超出±10%範圍。關於線性範圍的最低點應該是0、檢出限或是定量限的問題，個人趨向最低點為0，因為線性範圍隻是統計學上線性的表現，跟能否準確定量是兩方麵的問題。
