峰形不好？分離度不行？你需要這樣調整流動相！
發布日期：2021-11-09
核心提示：秘訣1：由強到弱一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或緩衝溶液)進行試驗，這樣可以很快地得到分離結果，然後根據出峰情況調整有機溶劑
一般先用90%的乙腈(或甲醇)/水(或緩衝溶液)進行試驗，這樣可以很快地得到分離結果，然後根據出峰情況調整有機溶劑(乙腈或甲醇)的比例。 每減少10%的有機溶劑(甲醇或乙腈)的量，保留因子約增加3倍，此為三倍規則。這是一個聰明而又省力的辦法。調整的過程中，注意觀察各個峰的分離情況。 當分離達到一定程度，應將有機溶劑10%的改變量調整為5%，並據此規則逐漸降低調整率，直至各組分的分離情況不再改變。1．流動相的性質要求一個理想的液相色譜流動相溶劑應具有低粘度、與檢測器兼容性好、易於得到純品和低毒性等特征。①流liu動dong相xiang應ying不bu改gai變bian填tian料liao的de任ren何he性xing質zhi。低di交jiao聯lian度du的de離li子zi交jiao換huan樹shu脂zhi和he排pai阻zu色se譜pu填tian料liao有you時shi遇yu到dao某mou些xie有you機ji相xiang會hui溶rong脹zhang或huo收shou縮suo，從cong而er改gai變bian色se譜pu柱zhu填tian床chuang的de性xing質zhi。堿性流動相不能用於矽膠柱係統。酸性流動相不能用於氧化鋁、氧化鎂等吸附劑的柱係統。②純度。色譜柱的壽命與大量流動相通過有關，特別是當溶劑所含雜質在柱上積累時。③必須與檢測器匹配。使用UVjianceqishi，suoyongliudongxiangzaijiancebochangxiayingmeiyouxishou，huoxishouhenxiao。dangshiyongshichazheguangjianceqishi，yingxuanzezheguangxishuyuyangpinchabiejiaodaderongjizuoliudongxiang，yitigaolingmindu。④粘度要低（應<2cp）。高粘度溶劑會影響溶質的擴散、傳質，降低柱效，還會使柱壓降增加，使分離時間延長。最好選擇沸點在100℃以下的流動相。⑤對樣品的溶解度要適宜。如果溶解度欠佳，樣品會在柱頭沉澱，不但影響了純化分離，且會使柱子惡化。采用反相色譜法分離弱酸（3≤pKa≤7）或弱堿（7≤pKa≤8）樣品時，通過調節流動相的pH值，以抑製樣品組分的解離，增加組分在固定相上的保留，並改善峰形的技術稱為反相離子抑製技術。對於弱酸，流動相的pH值越小，組分的k值越大，當pH值遠遠小於弱酸的pKa值時，弱酸主要以分子形式存在；對弱堿，情況相反。分析弱酸樣品時，通常在流動相中加入少量弱酸，常用50mmol/L磷酸鹽緩衝液和1%醋酸溶液；分析弱堿樣品時，通常在流動相中加入少量弱堿，常用50mmol/L磷酸鹽緩衝液和30mmol/L三乙胺溶液。注：流動相中加入有機胺可以減弱堿性溶質與殘餘矽醇基的強相互作用，減輕或消除峰拖尾現象。所以在這種情況下有機胺（如三乙胺）又稱為減尾劑或除尾劑。(三乙胺triethylamine 氨分子中的氫原子被3個乙基取代的產物。分子式(CH3CH2)3N。易揮發的無色液體，有氨的氣味。熔點－114.7℃，沸點89.3℃，相對密度0.7275（20／4℃）。溶於水和乙醇、乙醚等有機溶劑。三乙胺有堿性，與無機酸能生成易溶於水的鹽類。可由N，N- 二乙基乙酰氨與氫化鋁鋰反應製取，也可用乙醇胺進行氣相烷基化反應合成。用於製橡膠硫化促進劑、潤濕劑和殺菌劑等，也可用作溶劑和用於合成四級銨化合物)。3. 如何選擇緩衝液PH值在選擇緩衝液PH值之前，應先了解被分析物的Pka，高於或低於Pka兩個PH值單位的，有助於獲得好的、尖銳的峰，從HH公式：PH＝Pka＋log（[A-]/[A]）得知，溶液PH值高於或低於Pka兩個單位，化合物中99％以一種形式存在，而一種形式存在的化合物才能獲得好的尖銳的峰。顯示的是它的離子形式和中性化合物的轉變，苯甲酸的Pka等於4.2，理論上由HH公示得知，當溶液PH值等於2.2時，99％的苯甲酸以中性化合物存在，PH值等於6.2時99%的苯甲酸以離子形式存在，所以當緩衝液PH值等於2.2時，中性化合物以羧酸形式保留於反相柱，表1列出了一般緩衝液和他們的緩衝範圍。從表1知磷酸鹽和檸檬酸鹽緩衝液能用於PH值等於2.2。當化合物隻有氨基時，緩衝體係的選擇十分簡單，大多數氨基化合物在PH值小於9時都被質子化，所以所有PH值在7或更低的溶液均適合應用，你也許會問水的PH值大約是7，為什麼還用緩衝鹽，因為緩衝鹽有助於增加方法的可靠性，以及色譜峰的尖銳性，PH值的降低有助於氨基化合物保留的減弱，減小化合物與矽膠表麵矽羥基的作用，而使峰更尖銳，從表1 可知，任何緩衝液均可應用於氨基化合物的分析，但我們認為PH值等於3的磷酸鉀鹽最適合用於氨基化合物的分析。在上麵兩個例子中，PH＝3的de磷lin酸suan鉀jia鹽yan都dou能neng獲huo得de良liang好hao的de應ying用yong，在zai一yi般ban情qing況kuang下xia，它ta是shi含han羧suo基ji和he氨an基ji化hua合he物wu分fen析xi中zhong最zui好hao的de緩huan衝chong液ye，並bing且qie我wo們men認ren為wei在zai氨an基ji化hua合he物wu分fen析xi中zhong鉀jia鹽yan比bi鈉na鹽yan更geng好hao。HPLC所用流動相必須預先脫氣，否則容易在係統內逸出氣泡，影響泵的工作。氣泡還會影響柱的分離效率，影響檢測器的靈敏度、基線穩定性，甚至使無法檢測。（噪聲增大，基線不穩，突然跳動）。此外，溶解在流動相中的氧還可能與樣品、流動相甚至固定相（如烷基胺）反應。溶解氣體還會引起溶劑pH的變化，對分離或分析結果帶來誤差。溶解氧能與某些溶劑（如甲醇、四氫呋喃）形成有紫外吸收的絡合物，此絡合物會提高背景吸收（特別是在260nm以下），並導致檢測靈敏度的輕微降低，但更重要的是，會在梯度淋洗時造成基線漂移或形成鬼峰（假峰）。在熒光檢測中，溶解氧在一定條件下還會引起淬滅現象，特別是對芳香烴、脂肪醛、酮等。在某些情況下，熒光響應可降低達95%。在電化學檢測中（特別是還原電化學法），氧的影響更大。除去流動相中的溶解氧將大大提高UV檢測器的性能，也將改善在一些熒光檢測應用中的靈敏度。常用的脫氣方法有：加熱煮沸、抽真空、超聲、吹氦等。對混合溶劑，若采用抽氣或煮沸法，則需要考慮低沸點溶劑揮發造成的組成變化。超聲脫氣比較好，10~20分鍾的超聲處理對許多有機溶劑或有機溶劑/水混合液的脫氣是足夠了（一般500ml溶液需超聲20~30min方可），此法不影響溶劑組成。超聲時應注意避免溶劑瓶與超聲槽底部或壁接觸，以免玻璃瓶破裂，容器內液麵不要高出水麵太多。離線（係統外）脫氣法不能維持溶劑的脫氣狀態，在你停止脫氣後，氣體立即開始回到溶劑中。在1~4小時內，溶劑又將被環境氣體所飽和。在線（係統內）脫(tuo)氣(qi)法(fa)無(wu)此(ci)缺(que)點(dian)。最(zui)常(chang)用(yong)的(de)在(zai)線(xian)脫(tuo)氣(qi)法(fa)為(wei)鼓(gu)泡(pao)，即(ji)在(zai)色(se)譜(pu)操(cao)作(zuo)前(qian)和(he)進(jin)行(xing)時(shi)，將(jiang)惰(duo)性(xing)氣(qi)體(ti)噴(pen)入(ru)溶(rong)劑(ji)中(zhong)。嚴(yan)格(ge)來(lai)說(shuo)，此(ci)方(fang)法(fa)不(bu)能(neng)將(jiang)溶(rong)劑(ji)脫(tuo)氣(qi)，它(ta)隻(zhi)是(shi)用(yong)一(yi)種(zhong)低(di)溶(rong)解(jie)度(du)的(de)惰(duo)性(xing)氣(qi)體(ti)（通常是氦）將空氣替換出來。此外還有在線脫氣機。一yi般ban說shuo來lai有you機ji溶rong劑ji中zhong的de氣qi體ti易yi脫tuo除chu，而er水shui溶rong液ye中zhong的de氣qi體ti較jiao頑wan固gu。在zai溶rong液ye中zhong吹chui氦hai是shi相xiang當dang有you效xiao的de脫tuo氣qi方fang法fa，這zhe種zhong連lian續xu脫tuo氣qi法fa在zai電dian化hua學xue檢jian測ce時shi經jing常chang使shi用yong。但dan氦hai氣qi昂ang貴gui，難nan於yu普pu及ji。5．流動相的濾過所有溶劑使用前都必須經0.45µm（或0.22µm）濾過，以除去雜質微粒，色譜純試劑也不例外（除非在標簽上標明“已濾過”）。用濾膜過濾時，特別要注意分清有機相（脂溶性）濾膜和水相（水溶性）濾lv膜mo。有you機ji相xiang濾lv膜mo一yi般ban用yong於yu過guo濾lv有you機ji溶rong劑ji，過guo濾lv水shui溶rong液ye時shi流liu速su低di或huo濾lv不bu動dong。水shui相xiang濾lv膜mo隻zhi能neng用yong於yu過guo濾lv水shui溶rong液ye，嚴yan禁jin用yong於yu有you機ji溶rong劑ji，否fou則ze濾lv膜mo會hui被bei溶rong解jie！溶有濾膜的溶劑不得用於HPLC。duiyuhunheliudongxiang，kezaihunheqianfenbielvguo，ruxuhunhehoulvguo，shouxuanyoujixianglvmo。xianzaiyiyouhunhexinglvmochushou。liudongxiangdezhucunliudongxiangyibanzhucunyuboli、聚四氟乙烯或不鏽鋼容器內，不能貯存在塑料容器中。因許多有機溶劑如甲醇、乙酸等可浸出塑料表麵的增塑劑，導致溶劑受汙染。這種被汙染的溶劑如用於HPLC係統，可能造成柱效降低。貯存容器一定要蓋嚴，防止溶劑揮發引起組成變化，也防止氧和二氧化碳溶入流動相。磷酸鹽、乙酸鹽緩衝液很易長黴，應盡量新鮮配製使用，不要貯存。如確需貯存，可在冰箱內冷藏，並在3天內使用，用前應重新濾過。容器應定期清洗，特別是盛水、緩衝液和混合溶液的瓶子，以除去底部的雜質沉澱和可能生長的微生物。因甲醇有防腐作用，所以盛甲醇的瓶子無此現象。6．鹵代有機溶劑應特別注意的問題鹵代溶劑可能含有微量的酸性雜質，能與HPLC係統中的不鏽鋼反應。鹵代溶劑與水的混合物比較容易分解，不能存放太久。鹵代溶劑（如CCl4、CHCl3等）與各種醚類（如乙醚、二異丙醚、四氫呋喃等）混合後，可能會反應生成一些對不鏽鋼有較大腐蝕性的產物，這種混合流動相應盡量不采用，或新鮮配製。此外，鹵代溶劑（如CH2Cl2）與一些反應性有機溶劑（如乙腈）混合靜置時，還會產生結晶。總之，鹵代溶劑最好新鮮配製使用。如果是和幹燥的飽和烷烴混合，則不會產生類似問題。
編輯：songjiajie2010
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