由於影響因素過多，細胞/組織培養中出現的一些問題往往很難分析並得到解決
，因此被人戲稱為“黑色藝術”或“巫術”。本文列舉了一些動物細胞/組織培養中常見的問題及解決方法。
 
1.培養試劑的保存：
血清：-5oC - -20oC 保存，避免反複凍融。
培養基:  2oC – 8oC避光保存。
完全培養基: 2oC – 8oC避光保存，並在2周內用完。
盡量縮短血清和培養基見光的時間 
 
2.液體培養基中穀氨酰胺使用方法：
很多細胞生長要求在培養液中添加穀氨酰胺。穀氨酰胺在溶液中很不穩定
，應置於-20◦C冰凍保存，用前加入培養基中。加有穀氨酰胺的液體培養基4◦C 冰箱儲存兩周以上時
，應重新加入原來量的穀氨酰胺。另一種選擇是使用L-穀氨酰胺的衍生物 - L-alanyl-L-glutamine dipeptide（如啟維益成公司代理的GenDepot的產品Glutaplex配方中含有的成分之一） 替代L-穀氨酰胺。Glutaplex與L-穀氨酰胺相比更加穩定
，降解比較慢
，提高細胞的存活和生長，極大降低對細胞有毒性的氨的積累。
 
3.培養基中是否應加酚紅：
酚紅在培養基中被用來作為pHzhidezhishiji
，zhongxingshiweihongse
，suanxingshiweihuangse
，jianxingshizise。yanjiubiaoming

，fenhongkeyimoniguchunleijisudezuoyong，tebieshicijisu。weibimianguchunleifanying，peiyangxibaoyouqishiburuleixibaoshi

，yingshiyongbujiafenhongdepeiyangji。youyufenhongganraojiance
，yixieyanjiurenyuanzaizuoliushixibaojianceshibushiyongjiafenhongdepeiyangji。

4.使用血清應注意的問題：
1）血清第一次使用前，是否應在56oC，30分鍾加熱血清以滅活補體係統
？
激活的補體參與溶解細胞事件，刺激平滑肌收縮，細胞和血小板釋放組胺
，激活淋巴細胞和巨噬細胞。在進行免疫學研究、培養ES細胞

、昆(kun)蟲(chong)細(xi)胞(bao)和(he)平(ping)滑(hua)肌(ji)細(xi)胞(bao)時(shi)
，推(tui)薦(jian)使(shi)用(yong)熱(re)滅(mie)活(huo)血(xue)清(qing)。實(shi)驗(yan)顯(xian)示(shi)，經(jing)過(guo)正(zheng)確(que)處(chu)理(li)的(de)熱(re)滅(mie)活(huo)血(xue)清(qing)對(dui)大(da)多(duo)數(shu)的(de)細(xi)胞(bao)而(er)言(yan)是(shi)不(bu)需(xu)要(yao)的(de)。經(jing)此(ci)處(chu)理(li)過(guo)的(de)血(xue)清(qing)對(dui)細(xi)胞(bao)生(sheng)長(chang)隻(zhi)有(you)微(wei)小(xiao)的(de)促(cu)進(jin)或(huo)完(wan)全(quan)沒(mei)有(you)任(ren)何(he)作(zuo)用(yong)

，甚(shen)至(zhi)通(tong)常(chang)因(yin)為(wei)高(gao)溫(wen)處(chu)理(li)影(ying)響(xiang)了(le)血(xue)清(qing)的(de)質(zhi)量(liang)，而(er)造(zao)成(cheng)細(xi)胞(bao)生(sheng)長(chang)速(su)率(lv)降(jiang)低(di)。而(er)經(jing)過(guo)熱(re)處(chu)理(li)的(de)血(xue)清(qing)沉(chen)澱(dian)物(wu)的(de)形(xing)成(cheng)會(hui)顯(xian)著(zhu)的(de)增(zeng)多(duo)，這(zhe)些(xie)沉(chen)澱(dian)物(wu)在(zai)倒(dao)置(zhi)顯(xian)微(wei)鏡(jing)下(xia)觀(guan)察(cha)像(xiang)是(shi)“小黑點”，常常會讓研究者誤以為是血清遭受汙染。而把血清放在37℃huanjingzhongyouhuishicichendianwugengzengduo，shiyanjiuzhewurenweishiweishengwudefenliekuozeng。ruofeibixu，keyibuxuyaozuorechulizheyibu。budanjieshengshijian，gengquebaoxueqingdezhiliang。
 
2）通常使用的血清的種類：
新生牛血清：新出生牛5天內取血製成。小牛血清：小牛出生16周以內采血製成。胎牛血清：（進口血清）要求剖腹取胎製成。國內廠家往往不能做到，經常把出生2天以內采血稱為胎牛血清。根據血清的生產工藝及血紅蛋白、內毒素含量又分為：（1）特級胎牛血清：40納米過濾
，內毒素含量≤10EU，   血紅蛋白含量≤10mg/dl。（2）優等胎牛血清：經過3次100納米過濾，內毒素含量≤25EU/ml，血紅蛋白含量≤25mg/ml。（3）標準胎牛血清：3次100納米過濾，低內毒素，低血紅蛋白含量。
 
3）為什麼儲存在冰箱中的胎牛血清會出現沉澱?  
有些胎牛血清產品沒有預老化
，儲存在2-8℃時
，血清中的各種蛋白和脂蛋白，如冷凝集素、纖維蛋白原、玻粘連蛋白等可能聚集而形成沉澱或可見的混濁。這應該不會影響血清的質量。建議在-20℃儲存胎牛血清，避免反複凍融。
 
4）血清解凍後發現有絮狀沉澱物出現： 
血清中沉澱物的出現有許多種原因

，但最普遍的原因是由於血清中脂蛋白的變性所造成。而血纖維蛋白(形成凝血的蛋白之一)在(zai)血(xue)清(qing)解(jie)凍(dong)後(hou)也(ye)會(hui)存(cun)在(zai)於(yu)血(xue)清(qing)中(zhong)
，也(ye)是(shi)造(zao)成(cheng)沉(chen)澱(dian)物(wu)的(de)原(yuan)因(yin)之(zhi)一(yi)。但(dan)這(zhe)些(xie)絮(xu)狀(zhuang)沉(chen)澱(dian)物(wu)並(bing)不(bu)影(ying)響(xiang)血(xue)清(qing)本(ben)身(shen)的(de)質(zhi)量(liang)。若(ruo)欲(yu)去(qu)除(chu)這(zhe)些(xie)絮(xu)狀(zhuang)沉(chen)澱(dian)物(wu)


，可(ke)以(yi)將(jiang)血(xue)清(qing)分(fen)裝(zhuang)至(zhi)無(wu)菌(jun)離(li)心(xin)管(guan)內(nei)，以(yi)400g稍微離心，上清液即可接著加入培養基內一起過濾。最好不使用過濾的方法去除這些絮狀沉澱物
，因為它可能會阻塞過濾膜。
 
5）如何避免沉澱物的產生?  
我們建議您在使用血清的時候
，注意下列的操作: (1)解凍血清時
，請按照所建議的逐步解凍法(-2℃至4℃過夜，37oC水浴解凍)。若血清解凍時改變的溫度太大(如-20℃至37℃)
，非常容易產生沉澱物。(2)解凍血清時要隨時將之搖晃均勻，使溫度及成分均一，減少沉澱的發生。(3)請勿將血清置於37℃太久。若在37℃放置太久，血清會變得混濁，同時血清中許多較不穩定的成分也會因此受到損害，而影響血清的質量。(4)如果在高於40oC的水浴中融化並且不時常搖晃混勻，非常容易造成沉澱物增多。同樣血清的熱滅活也造成沉澱增多，若非必要，可以省去熱滅活。(5)若必須做血清的熱滅活
，請遵守56℃

，30分鍾的原則，並且隨時搖晃均勻。溫度過高
，時間過久或搖晃不均勻，都會造成沉澱物的增多。 
 
5.培養用液pH對細胞生長的影響：
由於，大多數細胞培養適宜的pH為7.2-7.4
，偏離此範圍對細胞將產生有害的影響。各種細胞對pH的要求也不完全相同，原代培養細胞一般對pH變bian動dong耐nai受shou力li差cha
，無wu限xian細xi胞bao係xi耐nai受shou力li強qiang。但dan總zong體ti來lai說shuo
，細xi胞bao耐nai酸suan性xing比bi耐nai堿jian性xing強qiang一yi些xie，偏pian酸suan環huan境jing中zhong更geng利li於yu細xi胞bao生sheng長chang。因yin此ci，我wo們men在zai配pei製zhi培pei養yang用yong液ye時shi，可ke把ba液ye體ti的depH稍微調得偏酸一些。液體在經過0.10um或0.22um濾膜過濾時
，溶液的pH還會向上浮動0.2左右。
 
6.培養基pH變化迅速：
培養箱中CO2濃度不正確。碳酸氫鈉在培養液中濃度範圍為2.0 – 3.7g/L時，CO2的濃度範圍應分別為5% - 10%。
 
7.使用培養基時應注意的問題：  
培養基在使用前需37oC預熱。 細xi胞bao培pei養yang過guo程cheng中zhong
，吸xi取qu過guo培pei養yang液ye的de吸xi管guan不bu能neng再zai用yong火huo焰yan燒shao灼zhuo，防fang止zhi殘can留liu在zai吸xi管guan內nei的de培pei養yang基ji焦jiao化hua，將jiang有you害hai物wu質zhi帶dai入ru培pei養yang液ye中zhong。盡jin量liang縮suo短duan各ge種zhong液ye體ti

、細胞的暴露時間，減少汙染機會。避免液體間
、細胞間的交叉汙染。配製完全培養基時，配製的量最好在2周內用完為好。
 
 
8.細胞傳代消化時胰蛋白酶的使用問題：
培養細胞胰蛋白酶溶液的消化能力和溶液的pH、溫度、胰酶濃度及溶液中是否含有Ca++, Mg+離子和血清等因素有關。通常情況下，pH 8.0 , 溫度 37 oC 其作用能力最強。另外，鈣、鎂離子及血清均能大大降低其消化能力。每次進行傳代消化前
，一定要用無鈣鎂離子的PBS液或D-Hanks液反複衝洗細胞培養瓶，以便將含血清的培養基衝洗幹淨
，這樣可大大提高消化液的消化能力。通常使用的消化液濃度為：   （1）０.０５％胰蛋白酶-ＥＤＴＡ；   （2）０.２５％胰蛋白酶-ＥＤＴＡ。多數細胞傳代消化可使用０.０５％胰蛋白酶-ＥＤＴＡ這種消化液。

第一次開瓶後應立即少量分裝於無菌管中，保存於–20℃，避免反複凍融造成胰蛋白酶活性降低，並可減少汙染的機會。

注意：如果選用無血清培養基（如啟維益成公司代理的TNC Bio公司生產的產品 - 完全無動物成分的血清替代品XerumFreeTM與其他培養基混合配製的無血清培養基），在細胞傳代時，不可使用胰蛋白酶消化，因為胰蛋白酶在無血清時可去除細胞膜表麵的受體
，這種情況應使用AccutaseTM消化。
 
9.貼壁細胞在用蛋白酶消化時不易分離：
1）培養液中存在酶的抑製劑，可使用無鈣鎂離子的37oC預熱的Dulbecco’s PBS或胰酶-EDTA洗一遍
，再消化 
2）胰酶濃度太低
，使用更高濃度的胰酶，更高濃度的EDTA或不同的酶消化，37oC消化以提高酶活性
3）細胞處於鋪滿狀態時間太長，形成細胞間的緊密連接
，以後注意在細胞鋪滿之前進行繼代培養。
 
10.細胞分離後形成團塊：
1) 細胞分散過程太過分，如用力吹吸、酶濃度過高、消化時間過長或溫度過高，酶溶液有毒性（如緩衝液pH或滲透壓不正確等）以至基因組DNA從破裂的細胞中釋放出來。解決方法是在細胞懸液中加入1滴無菌的1mg/ml溶於水中的DNA酶。
2)去除上清時
，細胞離心的強度太大或時間太長，應使用125g, 10分鍾輕微離心。
 
11.懸浮細胞形成團塊：
1）培養液中含有鈣鎂離子
2）支原體汙染 
3）由於過度消化造成細胞裂解
，釋放出基因組DNA
 
12.細胞不貼壁：
1）消化時間過長，細胞膜上的貼壁蛋白被去除了
2）培養基中的血清或貼壁因子（常見於無血清培養基）不足
，可在培養基中加入貼壁因子或使用膠原蛋白
、多聚L賴氨酸、纖連蛋白等包被的培養瓶。
3）支原體汙染
 
13.離心動物細胞的離心速率：?  
回收動物細胞

，離心速率一般為300g，5 - 10 分鍾，離心強度過大將造成細胞破裂死亡。
 
14.細胞生長緩慢：
1）換用了不同的培養基或血清，解決方法是可比較不同培養基成分，用生長實驗比較以前批次和新批次的血清， 提高接種細胞數，使細胞逐步適應新的培養基 。
2）L-穀氨酸等促進細胞生長的成分沒加入，用盡或分解了。用L-alanyl-L-glutamine dipeptide（如啟維益成公司代理的GenDepot的產品Glutaplex）替代L-穀氨酸 
3）支原體汙染或低水平細菌或真菌汙染
4）培養試劑保存不當
5）接種細胞數太少
6）細胞傳代次數太多
7）細胞傳代時密度太高，應在細胞鋪滿前的指數生長期傳代
 
15.細胞死亡：
1）培養箱中無CO2，檢查管子有無泄漏

，是否需更換CO2罐
，盡量減少開關培養箱的次數 
2）培養箱溫度不恒定
3）抗真菌劑或抗生素濃度過高，對細胞產生毒性
4）細胞在凍存或解凍過程中被破壞
5）培養基中滲透壓不正確
6）培養基中積累了有毒的代謝產物
 
16.細胞冷凍培養基的成份：
動物細胞冷凍保存時最常使用的冷凍培養基是含5 - 10 %DMSO (dimethyl sulfoxide) 和90 - 95 %原來細胞生長用的新鮮培養基均勻混合。注意：由於DMSO 稀釋時會放出大量熱能
，所以不可將DMSO 直接加入細胞液中，必須使用前先行配製完成。
 
17.DMSO的等級及使用和保存：
   冷凍保存使用之DMSO 等級必須為Tissue culture grade的DMSO (如Sigma D2650)。其本身即為無菌狀況
，第一次開瓶後應立即少量分裝於無菌試管中，保存於4°C。避免反複凍融造成DMSO 裂解而釋出有害物質
，並可減少汙染的機會。若要過濾DMSO
，則須使用耐DMSO 的Nylon 材質濾膜。
 
18.凍存液中的甘油的保存：
要避光保存，見光後甘油轉化為對細胞有毒性的丙烯醛。
 
19.細胞欲冷凍保存時注意事項：?
冷凍管內細胞數目一般為1x106 cells/ml，融合瘤細胞則以5x106 cells/ml為宜。實際操作時，建議按照細胞生產商建議的細胞密度凍存。凍存傳代次數低的細胞。
 
20.冷凍保存細胞之方法：?   
冷凍保存方法一: 冷凍管置於4℃ 30-60 分鍾→ （-20℃ 30 分鍾）→ -80℃16-18 小時(或隔夜) → 液氮槽vaporphase長期儲存
，如細胞浸在液氮中，有可能被液氮中的微生物汙染。   
冷凍保存方法二: 冷凍管置於已設定程序的可程序降溫機中每分鍾降1-3 ℃ 至–80 ℃ 以下，再放入液氮槽vapor phase長期儲存。-20℃不可超過1小時，以防止冰晶過大，造成細胞大量死亡。也可跳過此步驟直接放入-80℃ 冰箱中，但存活率降低。
 
21.細胞解凍：
快速解凍
，將37oC預熱的培養基逐滴加入解凍的細胞。
 
22.支原體汙染、檢測及處理：  
支原體汙染在細胞培養中最常見、buyibeizhajiao，danzhiyuantiwurankexianzhuyingxiangxibaogongnengganraoshiyanjieguo。zhiyuantishijieyuxijunhebingduzhijiandemuqiansuozhinengdulishenghuodezuixiaoweishengwu
，tawuxibaobi，xingtaichenggaoduduoxingxing，zuixiaozhijing0.2um，可通過濾器。課題組從國外引進細胞株/係也經常出現支原體的汙染。支原體在汙染細胞後

，它通過影響細胞的DNA
、RNA dehechengjijisuxiaohaopeiyangjizhongdeanjisuanlaiyizhixibaodeshengchang，bingnengjiangdixibaoderonghelv。yinci，zaiyunyonggezhongxibaoxijinxingshiyanyanjiushi，shouxianyaozhengmingsuoyongxibaoyouwuzhiyuantidewuran。zhiyuantiwuranhou，peiyangjikebufashenghunzhuo

，xibaobingbianqingweihuobumingxian，yincinanyifaxian。
目前，支原體檢測的方法有以下幾種。（a）相差顯微鏡觀察；（b）低張處理地衣紅染色法
；  （c）熒光染色法；（d）酶標法；  （e）PCR法：這是常用的一種簡便的檢測方法。  此方法靈敏度高

，檢測耗時短

，樣品量小（隻需50ul細胞培養用液上清），但引物及製劑費用較高。
支原體汙染的處理：1）丟棄細胞，培養基及其他培養用試劑 2）重新獲取未汙染細胞，新鮮培養基和試劑。