在反相色譜中隨著pH的增加，酸性化合物保留時間縮短，而堿性化合物延長；

緩衝液可以緩衝溶液pH的改變，緩衝液的定義是加入少量的酸或堿時能緩衝pH
，就是說添加酸或堿時pH的變化很小。這個保持pH的能力就叫做緩衝能力
，它是由緩衝液的濃度和緩衝鹽的pKa決定的
，緩衝鹽在pKa附近的緩衝能力最大。表1列出的是液相中一些常用的緩衝鹽的pKa。注意這是在水中測的，沒有加有機溶劑。當加入有機溶劑時
，pKa會有所變化，但是通常所有化合物的pKa，包括你的分析物的pKa都會有一樣的變化。

對於液相常用濃度來說
，緩衝液應維持在緩衝鹽的pKa的1.5個pH單位左右
，當濃度特別稀的時候，如低於5mM，就要把範圍縮小

，大概+/-1個pH單位。

表1：常用緩衝鹽的pKa值（25℃）

建議在開發方法的時候首先要選擇緩衝鹽和 pH範圍，然後用溶液的選擇性微調分離。這個策略快速而高效，而且可以讓你避免陷入緩衝液pH的泥潭。

1）建議溫度設置在25℃-40℃，適當的柱溫保持良好的保留時間的重現性，一定程度上提高柱效，增加分離度。

2）柱溫過低，流動相的粘度下降，色譜柱的背壓降低。

3）柱溫太高，與檢測器之間溫差太大，使峰變形，加快離子對試劑或緩衝鹽對矽膠基質的攻擊
，矽膠溶解
，縮短色譜柱的壽命
；柱溫太低

，使得需要製冷的柱溫箱
，硬件要求太高，不利於方法的推廣。

4）溫wen度du的de改gai變bian會hui導dao致zhi保bao留liu時shi間jian漂piao移yi，如ru果guo儀yi器qi自zi動dong進jin樣yang過guo夜ye或huo過guo周zhou末mo，就jiu會hui發fa現xian保bao留liu時shi間jian隨sui著zhe實shi驗yan室shi溫wen度du的de改gai變bian而er產chan生sheng漂piao移yi
，顯xian然ran這zhe種zhong問wen題ti用yong柱zhu溫wen箱xiang就jiu可ke以yi避bi免mian。