異常峰分析

異常的色譜峰指的是色譜圖中的無峰或出現負峰
、寬峰、雙峰
、肩峰、峰形不對稱等情況。異常峰是色譜實驗工作中最棘手的問題。這些峰嚴重影響色譜分析的結果。色譜圖中不可能有純正的高斯對稱峰 , 輕微的拖尾是正常的 , 這是由分離係統所決定的。在此僅對幾種異常峰進行分析。

1.峰前或峰後有小峰的分析

產生原因大致分為以下幾種情形

(1) 樣品不純。可改變不同的流動相和色譜柱 ,對樣品進行分離比較 , 選擇合適的分離條件。

(2) 分析柱或保護柱柱頭塌陷。此情況較常見 ,可更換分析柱或保護柱後對峰形進行比較。柱頭塌陷時往往所有的峰都會出現峰分裂 。對色譜柱再生和清洗可以改善分離效果。

(3) 色譜柱柱容量下降。當長時間使用後 , 有一些強保留組分吸附在柱子中 , 不大的進樣量往往就會出現峰分裂。用強洗脫能力的溶劑清洗色譜柱 , 或更換色譜柱可使問題得到改善。

(4) 樣品溶劑與流動相不匹配或進樣體積過大。當樣品溶劑比流動相極性大時 , 有時即使進樣體積很小 , 也容易出現峰變形和裂分現象。建議用流動相溶解樣品。

(5) 流動相不恰當。此情況較罕見 , 有些樣品在特定的色譜條件下可能存在結構的動態平衡 , 而出雙峰 , 這種雙峰是無法分離完全的 , 改變色譜條件尤其是p H 值會使峰形正常。

(6) 樣品分解。不穩定的樣品在色譜分離過程中變成其他物質而出現雙峰。這時需改變樣品處理方法或色譜分離條件。

2.負峰分析

在色譜分析中有時會出現負峰或倒峰 , 如圖 3 中的大峰的左下就有一負峰。出現這種現象可能是由以下幾種原因引起的 , 可針對不同情況進行排除 , 進而使問題得到解決。

(1) 流動相吸收本底值過高。此時可適當改變檢測波長。

(2) 進樣過程中進入空氣。進行排氣處理 , 直到基線平穩再進樣。

(3) 樣品組分的吸收低於流動相。可改變流動相或改變檢測波長。

(4) 配製樣品的溶液與流動相不一樣。重新配製樣品 , 用與流動相一樣的溶劑配製或稀釋樣品。

3.前沿、拖尾峰分析

拖尾：1 幹擾峰，優化條件分離 ；2 色譜柱塌陷
，更換色譜柱； 3 流動相pH不合適，調節pH值 

；4 管路沒有接好
，存在較大的死體積，可以重新接一下。

前沿：1 溶劑選擇不合適，選擇合適的溶劑 
；2 樣品過載，降低進樣量； 3 柱溫太低，升高柱溫 ；4 色譜柱損壞，更換色譜柱 ；

圖tu譜pu前qian沿yan和he拖tuo尾wei的de原yuan因yin主zhu要yao是shi流liu動dong相xiang選xuan擇ze不bu合he適shi
，可ke以yi相xiang應ying調tiao整zheng流liu動dong相xiang的de極ji性xing，或huo者zhe適shi當dang加jia入ru酸suan來lai調tiao整zheng，可ke以yi得de到dao較jiao好hao的de改gai善shan。一yi般ban來lai講jiang，酸suan堿jian在zai流liu動dong相xiang中zhong對dui於yu前qian沿yan和he拖tuo尾wei影ying響xiang較jiao大da。  柱前沿是可能因為柱超載，拖尾是可能因為樣品被汙染，選擇合適的流動相，調節好PH能夠改善這以情況。

前輩們總是會告訴我們
，拖尾峰與柱子有關，可能是過載，稀釋樣品再做，或換新柱做。 有時候托尾峰往往是有機性相近雜質沒有分開，此時，可以優化分析方法，或更換柱子試一試；也可能由於柱子使用時間太久柱效下降出現塌陷等原因；再有也會根樣品本身性質有關，基團需要流動相中添加能與之結合優化峰形的化學物質，要根據具體情況而定。

4.色譜雙峰產生的可能及判斷和處理

液相上有一句經典的話說得好 “出兩個峰肯定不是一種物質，出一個峰不一定是一種物質”。

而色譜雙峰指的是明是一種物質
，但在色譜圖中出現雙峰，而表明含二種物質。我將這種情況分為四種原因。  

1）色譜柱  

如果你分析樣品時發現每個色譜峰都雙峰出現（出峰越快
，雙峰的可能性會減少），尤其采用單一純物質時，可以肯定色譜柱出問題－zhutoushousunhuozhutougudingxiangbianzanghuoliushi。ruguojinyangliangshao
，yuanlaisepuzhuzhengchang，sepufengdexingzhuangduoweiyidafengdaiyixiaofeng，buyidingtuowei
，zheyibanyingshizhutoushoudu
，jiangsepuzhufanguolaijie
，yongliudongxiangchongxihuosuanxihuoqitarongji
，jiangduzaizhutoudecanliuwuchongdiao，zaifanguolai，yibanqingkuangxiajiuxingle。dangranbufanchong


，zhengchongyoushiyehuizhengchangde。ruguofengtuowei，shuangfengqiangruoxiangchabuda，zhutougudingxiangbianzanghuoliushikenengxinggengda

，gaopinhongwaitanliufenxiyizheshikeyijiangjinyangnatouningkai，jiangweikonglvpianchaosheng
，zhutouguaquyibufentianliao，zhongxintianshangxintianliaoningjin
，buguozhezhonghuo
，xuyaoyidingjishu，tongshibunenglaogannazhongshi，fouzeyongbulejici，sepuzhujiuhuiyingzhuxiaohendierbaofei。  

2）溶劑極性及進樣量  

許多HPLC分析者對此可能不以為然
，一般的HPLC的書籍和文獻都不會提到這方麵的內容，而這確是雙峰產生的一個很重要的原因。目前HPLC分析多為反相色譜，流動相多為甲醇、乙腈
、水shui，加jia各ge種zhong添tian加jia劑ji以yi改gai善shan分fen離li性xing能neng。樣yang品pin一yi般ban用yong與yu流liu動dong相xiang相xiang溶rong的de溶rong劑ji溶rong解jie。最zui佳jia的de溶rong解jie方fang法fa是shi用yong流liu動dong相xiang溶rong解jie
，但dan是shi很hen多duo情qing況kuang是shi不bu一yi致zhi的de。當dang用yong溶rong劑ji極ji性xing強qiang度du大da的de試shi劑ji，如ru純chun甲jia醇chun、純乙腈，純乙醇
，而分析體係中以水為主
，樣品進樣量大，如定量管為20ul，此條件下完全可以肯定
，單一的純物質出雙峰，第二峰比第一峰小（每次都不太一樣）


，且拖尾，保留時間會提前（相對進樣量少而言），將(jiang)進(jin)樣(yang)量(liang)減(jian)少(shao)一(yi)半(ban)以(yi)上(shang)，峰(feng)型(xing)將(jiang)變(bian)為(wei)正(zheng)常(chang)。這(zhe)是(shi)樣(yang)品(pin)的(de)溶(rong)劑(ji)與(yu)流(liu)動(dong)相(xiang)極(ji)性(xing)相(xiang)差(cha)太(tai)大(da)，而(er)流(liu)動(dong)相(xiang)來(lai)不(bu)及(ji)將(jiang)其(qi)稀(xi)釋(shi)達(da)到(dao)平(ping)衡(heng)造(zao)成(cheng)的(de)。上(shang)麵(mian)提(ti)到(dao)進(jin)樣(yang)量(liang)造(zao)成(cheng)雙(shuang)峰(feng)的(de)一(yi)個(ge)原(yuan)因(yin)，另(ling)一(yi)個(ge)原(yuan)因(yin)是(shi)
，進(jin)樣(yang)量(liang)不(bu)一(yi)定(ding)大(da)
，但(dan)絕(jue)對(dui)量(liang)很(hen)大(da)

，色(se)譜(pu)圖(tu)上(shang)的(de)雙(shuang)峰(feng)緊(jin)靠(kao)在(zai)一(yi)起(qi)，基(ji)本(ben)上(shang)齊(qi)高(gao)，不(bu)拖(tuo)尾(wei)（如果出峰很快
，也可能是色譜柱問題）。將樣品稀釋再進樣就可以了
，這是由於進樣量過大，色譜柱過載造成的。  

3）樣品的特性  

有(you)些(xie)樣(yang)品(pin)由(you)於(yu)其(qi)化(hua)學(xue)結(jie)構(gou)的(de)特(te)點(dian)
，存(cun)在(zai)互(hu)變(bian)異(yi)構(gou)現(xian)象(xiang)
，而(er)這(zhe)種(zhong)互(hu)變(bian)異(yi)構(gou)體(ti)無(wu)法(fa)分(fen)開(kai)
，而(er)是(shi)以(yi)一(yi)個(ge)動(dong)態(tai)平(ping)衡(heng)存(cun)在(zai)。在(zai)色(se)譜(pu)分(fen)析(xi)時(shi)，在(zai)一(yi)個(ge)特(te)定(ding)的(de)條(tiao)件(jian)下(xia)
，一(yi)種(zhong)物(wu)質(zhi)將(jiang)出(chu)現(xian)雙(shuang)峰(feng)

，雙(shuang)峰(feng)靠(kao)的(de)很(hen)近(jin)，基(ji)本(ben)齊(qi)高(gao)，不(bu)拖(tuo)尾(wei)
，條(tiao)件(jian)稍(shao)一(yi)變(bian)化(hua)，尤(you)其(qi)pH，雙峰現象將消失
，如紅黴素等。有的樣品紫外的色譜圖上看不到雙峰
，但在LC－MS下，用質譜檢測器
，其質譜的總離子流圖上較明顯，例如我分析過的農藥啶蟲眯（吡蟲清）。  

4）參數

記錄的參數一般都內定的
，不必修改
，但GC和HPLC的參數是不完全一致的，例如C－R3A數據記錄儀上的一般記錄時間間隔GC為2ms，HPLC 為5ms，如果記錄間隔時間縮短，一個峰將變為二個峰或更多。

5.鬼峰、倒峰、未出峰

6.峰裂分

裂峰產生原因的確定

• 樣品基質複雜或分析多種樣品——柱汙染或部分阻塞濾片

• 流動相 pH>=7——由於矽膠溶解導致柱塌陷(除非使用專門的柱子)

• 溶劑比流動相的強度大——可能產生裂峰或寬峰，由樣品量決定 （溶劑化效應）

7.峰拖尾
、峰展寬、峰前伸

峰拖尾原因的確定

• 評價柱選擇——使用高純度矽膠柱或不同鍵合技術柱

• 評價流動相效果——改變流動相pH和添加劑消除次級效應(流動相中組份與柱子相互作用)

• 減小進樣量

• 消除柱外效應

• 衝洗柱子——檢查柱子老化/塌陷

易記小卡片來了：其它常見峰異常問題彙總

Q&A峰問答

進行HPLC分析時，怎樣才能知道某一個色譜峰是否是單一峰呢
？特別是分析中藥成分的時候？標準品加入法、DAD、還有改變流動相的組成是否能說明呢
？

1、多種不同原理的方法比較是首選。

2
、其次采用DAD檢測器進行光譜分析，如果提示不純
，估計有問題。純度閾值受儀器、流動相等影響
，所以隻能作為參考。對於分子結構中差異有紫外吸收官能團的，dad檢測器一般還是可以準確判斷峰純度的
，但對於結構中無紫外吸收的那些差異，DAD檢測器就無能為力了，比如某肽鏈中的氨基酸差異、或者一些對應異構體，dad也是無能為力的。

3
、如果DAD不(bu)行(xing)，那(na)麼(me)就(jiu)需(xu)要(yao)采(cai)用(yong)質(zhi)譜(pu)鑒(jian)別(bie)了(le)，優(you)選(xuan)液(ye)質(zhi)聯(lian)用(yong)
，如(ru)果(guo)是(shi)含(han)鹽(yan)流(liu)動(dong)相(xiang)，可(ke)以(yi)采(cai)用(yong)收(shou)集(ji)不(bu)同(tong)時(shi)段(duan)的(de)色(se)譜(pu)流(liu)出(chu)物(wu)的(de)方(fang)式(shi)，脫(tuo)鹽(yan)，進(jin)行(xing)質(zhi)譜(pu)檢(jian)測(ce)。

4、如果懷疑有異構體，這個就比較頭疼了，非對應異構體需要二級（主要是對CID的能量有要求
，可以打斷側鏈）的質譜才能判斷側鏈的區別。對應異構體的辨別目前好像隻有waters的離子淌度質譜（沒做過）有一定的分辨能力，但也不是萬能的。